D’après les recherches, il a été fermement établi que les principales unités structurelles de la molécule d’acide humique sont liées entre elles par de simples liaisons éther. Ce dernier peut être hydrolysé.
À la suite de l’hydrolyse, comme on le croit généralement aujourd’hui, la molécule d’acide humique se décompose en ses éléments structurels constitutifs. Les substances de la série aliphatique, qui représentent la partie périphérique de l'acide, reliées au noyau par de simples liaisons éther, passent en solution. Les noyaux d'acides humiques, selon la majorité des chercheurs, ne sont pas sujets à l'hydrolyse et donc, libérés des chaînes périphériques, devraient rester dans le sédiment.
Dans notre étude, nous avons profité de cette disposition et isolé des fractions individuelles d’acides humiques selon le schéma présenté dans la Fig. 1.
Méthodologie de recherche
La préparation d'humate sèche , qui a ensuite été soumise à une hydrolyse, a été obtenue à partir de tourbe. Les acides humiques et fulviques ont été extraits de la tourbe par ébullition avec 3 % de NaOH, après quoi ils ont été précipités avec 10 % de HCl. Le gel d'acide humique a été recueilli sur un filtre, lavé à l'eau jusqu'à l'obtention d'un test de chlore négatif, puis reprécipité, séché à une température de 45 à 60 °C, broyé en poudre et utilisé dans des expériences sous cette forme.
L'hydrolyse de l'acide humique a été réalisée de la même manière que celle habituelle pour les protéines. Un échantillon de 1 g d'acide a été placé dans un tube à essai, rempli de 10 ml de HCl 6 N, le tube à essai a été scellé et placé dans une étuve pendant 6 heures à une température de 125-130°C.
Nettoyage des fractions
Après hydrolyse, les produits de décomposition ont été extraits de l'ampoule. Les noyaux d'acide humique (résidu après hydrolyse) ont été séparés de l'hydrolysat par filtration. Étant donné que les deux fractions contenaient beaucoup de chlore et qu’elles devaient être testées dans une expérience en pot, elles nécessitaient une purification préliminaire. La méthode de purification était différente pour les fractions obtenues.
Faction n° 1
Le résidu après hydrolyse, qui, contrairement à l'acide humique d'origine, était de couleur complètement noire et peu soluble dans les alcalis, a été lavé sur un filtre jusqu'à l'obtention d'un test négatif pour le chlore. On en a ensuite préparé de l'humate de sodium. Pour 100 mg de résidu non hydrolysable, 2 ml de NaOH 0,1 N ont été prélevés. Sous la forme d'un tel composé, cette fraction a été utilisée dans l'expérience et, selon notre hypothèse, a caractérisé les propriétés physiologiques du noyau d'acide humique.
Fractions n° 2 et n° 3
La purification de l’hydrolysat à partir de l’acide chlorhydrique s’est avérée plus difficile. Nous avons testé une méthode connue dans la littérature pour purifier l'hydrolysat du chlore par évaporation répétée sous vide (fraction n°2). Cependant, comme certains sels minéraux sont passés dans l’hydrolysat, entraînant la formation de chlorures, il s’est avéré impossible de se débarrasser complètement du chlore. Par conséquent, d’autres méthodes de nettoyage ont également été testées et se sont avérées plus préférables. L’une d’entre elles consiste à dialyser l’hydrolysat dans un sac en cellophane à contre-courant de l’eau jusqu’à ce que l’échantillon de chlore disparaisse de l’eau de lavage. Après la dialyse, il restait dans le sac une solution colorée qui a été utilisée dans l'expérience (fraction n° 3) et un petit sédiment qui a été retiré. Le sédiment était particulièrement visible lorsque l'hydrolysat était neutralisé avec de l'hydroxyde de sodium avant la dialyse (fraction n° 3-a).
Séparation chromatographique
Une approche originale pour étudier la composition des substances humates est leur séparation chromatographique sur charbon actif suivie d'une élution des composés adsorbés avec divers solvants. Cette méthode pour ces substances a été proposée pour la première fois par Forsyth (1947), puis utilisée avec succès par Dragunov et Khan.
Plus tard, des travaux de Drozdova sont apparus, qui a développé une méthode de purification des acides fulviques par fractionnement sur carbone. Nous avons utilisé cette technique, considérant que la purification des acides fulviques à partir d’une solution acide et la purification d’un hydrolysat acide ont beaucoup en commun. L'hydrolysat, comme les acides fulviques, a une couleur orange et est soluble dans les alcalis et les acides. Lors de la neutralisation, au point de transition de couleur, le congorot forme partiellement un précipité qui, après une alcalinisation ou une acidification supplémentaire, passe à nouveau en solution.
Fractions n° 4, n° 5 et n° 6
Des composés de nature non aromatique, tels que les acides aminés, les sucres aminés, les alcools de sucre, les glucides, les acides uroniques, etc., sont également transférés à l'hydrolysat d'acide humique, dont l'activité doit également être testée. En utilisant la méthode Forsythe modifiée par Drozdova, il a été possible de séparer l'hydrolysat en au moins deux fractions et d'étudier chacune d'elles séparément.
Pour ce faire, l’hydrolysat a été passé à travers une couche de charbon actif. La solution traversant le charbon était incolore et contenait, selon Drozdova, des sels inorganiques, de l'acide chlorhydrique, des acides aminés, des bases azotées, des glucides simples, etc. Cette solution, dans la mesure du possible, a été épaissie et purifiée du chlore sous vide puis introduite dans l'expérience (fraction n° 4). Les substances colorées de l'hydrolysat, adsorbées sur du charbon, ont été éliminées avec un mélange d'acétone et d'alcali. L'acétone a ensuite été distillée à partir de l'éluat, le résidu a été dialysé dans un sac en cellophane jusqu'à ce que l'eau de lavage soit négative pour la phénolphtaléine et a été utilisée dans l'expérience (fraction n° 5). Cette fraction avait une couleur jaune citron dans un environnement acide et une couleur orange dans un environnement alcalin. Par analogie avec la purification des acides fulviques, on peut supposer que la fraction adsorbée sur charbon contient une substance de nature quinoïde, car elle n'a pas donné de réaction positive avec l'α-naphtol, le réactif de Millon et le chlorure ferrique, mais a changé de couleur en fonction de la réaction du milieu et avait une forte odeur de chlore.
Il est à noter que pour éviter d'éventuelles pertes lors de la désorption et de la dialyse, la fraction spécifiée de l'hydrolysat a également été testée directement sous forme adsorbée sur charbon. Dans ce cas, après le passage de l'hydrolysat, le charbon actif a été lavé du chlore, séché, broyé et utilisé dans l'expérience (fraction n° 6).
Résultats de la recherche
L'activité biologique des fractions obtenues par la méthode ci-dessus et de l'acide humique d'origine sous forme d'humate de potassium a été étudiée dans des cultures aquatiques. De l’eau distillée a été utilisée comme témoin.
4 à 6 mg de préparations d’acide humique ont été ajoutés à un récipient de 0,5 litre. Les substances adsorbées sur charbon actif ont été introduites sur la même base. Le tableau 1 montre l’effet de différentes fractions d’acide humique sur la croissance des racines de l’orge, du blé et des tomates.
| Cultures | Eau | Humate de sodium (standard) | L'acide humique comme adsorbant | Le charbon actif comme adsorbant | Hydrolysat adsorbé sur charbon (fraction n° 6) | Humate de potassium provenant de résidus non hydrolysables (fraction n° 1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Blé | 51,2 | 391,6 | --- | 283,3 | 353,3 | 401.2 |
| Orge | 61,7 | 419.1 | --- | 286,6 | 401.2 | 423,3 |
| Tomates | 47,7 | 60,9 | 30,7 | 44,4 | 70,0 | --- |
Ces données indiquent que les fragments de molécules d’acide humique sont biologiquement actifs. L'humate de potassium préparé à partir de résidus non hydrolysables n'est pas inférieur à une solution standard d'humate de potassium pour stimuler la croissance des racines. Par conséquent, le noyau d’acide humique joue évidemment un rôle majeur dans la stimulation de la croissance des racines. Parallèlement, l'expérience constate également une stimulation assez forte par des substances qui, après hydrolyse, s'adsorbent sur le charbon. Si l'on prend en compte que ces substances sont des composés polyphénoliques et quinoniques, l'effet obtenu dans l'expérience peut s'expliquer par leur influence directe sur la plante.
Nous avons également remarqué que le charbon actif lui-même, en tant qu’adsorbant, provoque également une croissance accrue des racines. Certains chercheurs expliquent cet effet par la capacité du charbon à adsorber les ions hydrogène libérés par le système racinaire, grâce à quoi le charbon favorise le processus de respiration et de nutrition minérale des plantes. P. A. Vlasyuk, par exemple, recommande d'ajouter du lignite aux rangs comme adsorbant, ce qui réduit la concentration de sels dans la zone racinaire et améliore la nutrition des cultures.
Par conséquent, dans l'expérience avec les tomates, nous avons utilisé du charbon actif, qui a été lavé avec de l'acide chlorhydrique fort avant l'expérience, puis lavé du chlore, une partie a été utilisée pour l'adsorption de l'hydrolysat, et l'autre partie a été introduite dans l'expérience sous forme pure. En comparant la durée de croissance des racines de blé, d'orge et de tomate, on constate que le charbon actif contient des impuretés qui peuvent fausser les résultats de l'étude, car elles favorisent la croissance des racines. La substance adsorbée sur le charbon dans ce cas s'avère également biologiquement active.
Cette expérience permet également de conclure que l'acide humique lui-même, sous forme de gel finement broyé, n'a aucun effet en tant qu'adsorbant. Ces adsorbants ont en réalité des propriétés différentes, car ils ont des capacités d’absorption différentes (tableau 2).
| Adsorbant | Capacité d'absorption (%) |
|---|---|
| charbon actif | 11,8 |
| Charbon actif traité au HCl | 11.3 |
| Charbon actif avec hydrolysat adsorbé | 10.6 |
| Gel d'acide humique | 5.4 |
| Résidu non hydrolysable | 0,0 |
Une comparaison des capacités d'absorption du gel de carbone et d'acide humique montre que si l'effet positif du carbone sur la croissance des racines dans nos expériences était expliqué par la capacité d'adsorption, le gel d'acide humique aurait également été efficace, alors qu'en fait il a même légèrement inhibé la croissance des racines.
Ci-dessous (tableau 3) se trouvent les résultats d’une expérience dans laquelle des fractions d’acide humique ont été testées après désorption du charbon actif.
| Options d'expérience | Orge (expérience n° 1) | Tomates (expérience n°2) | Orge (expérience n° 3) |
|---|---|---|---|
| Eau (contrôle) | 116,6 | 47,7 | 295,0 |
| Humate de potassium (standard) | 146,6 | 60,9 | 365,0 |
| Hydrolysat après élimination du chlore (fraction n° 2) | --- | --- | 395,0 |
| Fraction d'hydrolysat désorbée du charbon actif (fraction n° 5) | 261,6 | 65,9 | --- |
| Fraction d'hydrolysat non adsorbée par le carbone (fraction n° 4) | --- | --- | 230,0 |
| Hydrolysat après dialyse (fraction n° 3) | 131,6 | 62.1 | --- |
| Hydrolysat après dialyse avec neutralisation préliminaire (fraction n° 3-a) | 183,3 | 53,6 | --- |
Conclusions
Il ressort de ces expériences que le mélange de produits d'hydrolyse (fraction n° 2) est plus actif que la fraction de substances qui n'est pas adsorbée sur le carbone et qui comprend vraisemblablement les chaînes périphériques d'acides humiques. Par conséquent, l'activité biologique des acides humiques dépend évidemment de la fraction qui est adsorbée sur le carbone et qui, selon un certain nombre de caractéristiques, présente une structure polyphénolique.
La pré-neutralisation de l'hydrolysat avec un alcali avant la dialyse entraîne une diminution de l'effet stimulant, apparemment due au fait qu'à la suite de la neutralisation, les substances actives passent dans le sédiment, qui est éliminé après la dialyse.