Fotólisis y Deformación de Sustancias Húmicas bajo la Influencia de la Luz, la Humedad y la Temperatura
Muchos investigadores han establecido el efecto positivo, y en algunos casos negativo, de las sustancias húmicas, incluidos los preparados húmicos, sobre las condiciones nutricionales y el desarrollo de las plantas. La naturaleza del fenómeno y el mecanismo de interacción de los ácidos húmicos con las plantas son discutibles, pero independientemente de esto, adquiere importancia fundamental la pregunta: ¿por qué dosis relativamente pequeñas de fertilizantes húmicos pueden ser efectivas en suelos que contienen cantidades significativamente mayores de las mismas sustancias?
Una respuesta general a esta pregunta la proporciona la analogía con el concepto de disponibilidad de elementos de nutrición mineral y nitrógeno para las plantas. Aplicado a los ácidos húmicos, este concepto es mucho más amplio y obviamente incluye:
- su movilidad (solubilidad) en los suelos;
- la interacción con componentes minerales;
- el tamaño y la configuración de las moléculas;
- la calidad de las moléculas mismas: contenido de grupos funcionales, centros paramagnéticos, etc.
Por lo tanto, al caracterizar la acción fisiológica de las sustancias húmicas, es más correcto hablar no de disponibilidad, sino de su **actividad** o de los componentes activos del humus.
Una de las razones de la mayor actividad de los preparados húmicos, en comparación con los ácidos húmicos nativos de los suelos, reside, en nuestra opinión, en los cambios que se producen en ellos durante la preparación de los mismos. Además de la destrucción de los enlaces órgano-minerales, la acción de las soluciones alcalinas y otros factores puede causar:
- hidrólisis de los ácidos húmicos, su oxidación;
- cambiar la naturaleza de la distribución de peso molecular de las partículas;
- conducir a un cambio en la configuración y conformación de las moléculas.
Fenómenos de este tipo, que no cambian la pertenencia de los compuestos a la clase de ácidos húmicos, pero que influyen en los detalles de la estructura, pueden unirse bajo el término "**desnaturalización**", entendiéndola en un sentido más amplio de la palabra de lo que ocurre en la química de proteínas. Hemos investigado algunos de los procesos de desnaturalización de los ácidos húmicos que ocurren bajo la influencia de su secado, calentamiento e iluminación.
Deformación de Moléculas de Ácidos Húmicos bajo la Influencia de la Humedad y el Secado
Las diferencias en la configuración de las moléculas de humatos y ácidos húmicos en estado húmedo (disuelto) y en estado seco se aprecian claramente al medir las densidades relativas. La disminución de los volúmenes molares de las proteínas al disolverse en agua es bien conocida. Los ácidos húmicos secos son prácticamente insolubles en agua, por lo que medimos su densidad primero en agua («preparado seco») y luego en soluciones débiles de KOH.
En soluciones diluidas de KOH, los volúmenes específicos de los ácidos húmicos disminuyen, y las densidades aumentan, al aumentar la concentración de álcali (Fig. 1). Con un aumento posterior de la concentración de álcali, cuando prácticamente se neutralizan completamente todos los grupos carboxilo y todos o la mayoría de los grupos fenólicos, la densidad disminuye, alcanzando valores menores que en estado seco.
Tal cambio en la densidad puede explicarse por el hecho de que los preparados secos de ácidos húmicos son poco hidrófilos, y la introducción de una pequeña cantidad de álcali cambia drásticamente el estado de la sustancia. La aparición de cargas negativas debido a la formación de iones carboxilato provoca la disolución de parte del preparado. Las moléculas de agua se orientan y se compactan cerca de los grupos ionógenos, lo que conlleva una aparente disminución del volumen específico; el valor de densidad medido aumenta. La unión del agua se confirma por el grado de hidratación de los humatos, que según los datos viscométricos es de al menos 1,2–2,5 g de agua por 1 g de ácido húmico.
Con la neutralización posterior de los grupos carboxilo, aparece una gran cantidad de cargas negativas; su repulsión mutua contribuye al enderezamiento de las cadenas moleculares y la sustancia tiende a ocupar un volumen mayor que en estado seco. Un fenómeno similar es conocido para el ARN, cuya molécula adquiere una estructura rígida de «barra» bajo la acción de la repulsión electrostática de los grupos ionizados vecinos. De acuerdo con estas representaciones, el apilamiento de los ácidos húmicos, el grado de orientación de las moléculas, no pueden ser iguales en estado seco y en gel. En geles (preparados «hinchados»), las moléculas de ácidos húmicos deben disponerse de manera más ordenada que en los preparados secos.
Para verificar esta última suposición, obtuvimos difractogramas de geles de algunos ácidos húmicos, y luego difractogramas de las mismas muestras después de secarlas al aire. Los preparados secos de ácidos húmicos no tienen reflejos claros; la imagen de difracción está borrosa, la intensidad de las reflexiones es pequeña: su máximo se encuentra en la región de 3,5–3,7 Å (Fig. 2).
Las intensidades de las reflexiones en los geles aumentan bruscamente, y los difractogramas difieren ligeramente de los preparados secos en el carácter de la distribución de las intensidades de reflexión (Fig. 2). El aumento de las intensidades de las reflexiones se debe, sin duda, a la mayor ordenación de la disposición de las moléculas. Tanto la polidispersidad como la deformación de las moléculas dificultan la ordenación en estado seco. El máximo de intensidad se desplaza de 3,5–3,7 Å a 3,3–3,1 Å, lo que sugiere una mayor deformabilidad de los elementos estructurales con mayores períodos de repetición.
Otros datos también indican la deformabilidad de las moléculas de ácidos húmicos. Generalmente, las micrografías electrónicas indican una forma redondeada de las partículas de ácidos húmicos. Sin embargo, las determinaciones viscométricas indican una conformación elipsoidal de las partículas con una relación de ejes de 1:6. Es probable que, incluso al pasar de las soluciones de humatos utilizadas en la viscometría a los precipitados secos (microscopía electrónica), la deformación de las moléculas conduzca a un cambio en la forma de las partículas (o asociados) de alargada a redondeada.
Las imágenes de la superficie de los preparados secos, obtenidas con un microscopio de barrido (Fig. 3, 4), pueden servir como confirmación adicional de la deformación de los ácidos húmicos y fúlvicos durante el secado. La disposición en capas de las partículas es claramente visible en las imágenes. Las grietas y fracturas profundas indican una deformación significativa de las moléculas de materia orgánica durante el secado.
Los resultados obtenidos permiten suponer que los ácidos húmicos recién formados cuyas moléculas están más enderezadas poseen la máxima actividad en los suelos. Son más móviles, reaccionan enérgicamente con los componentes minerales y orgánicos y participan en la formación de la estructura. El envejecimiento de los ácidos húmicos que se produce como resultado del secado se acompaña de:
- deformación de las moléculas;
- pérdida de solubilidad;
- bloqueo intramolecular de parte de los grupos funcionales.
Todo esto conduce a una disminución de su efecto sobre las plantas.
Fotólisis y Cambio en la Composición de Peso Molecular bajo la Acción de la Luz
La luz ejerce una acción diferente sobre las soluciones de ácidos húmicos. En nuestros experimentos se utilizó la radiación de lámparas de mercurio-cuarzo BUV—15 (radiación monocromática con una longitud de onda de 2537 Å) y PRK—7 (espectro de emisión discreto en el rango de 312–611 nm). Las soluciones de ácidos húmicos, colocadas en cubetas de cuarzo cilíndricas herméticamente cerradas, se sometieron a la acción de la luz. Los disolventes utilizados fueron soluciones 0,1 N y 0,01 N de hidróxido de sodio y agua destilada. La acción de la luz se controló mediante espectros de absorción electrónica.
En todas las variantes de los experimentos se encontró una caída significativa de la densidad óptica ya después de 10–15 minutos de irradiación continua, y después de 15–25 horas, en varios casos, las soluciones se decoloraron prácticamente por completo (Fig. 4). El carácter de los espectros apenas cambió (Fig. 5), solo se notó un cambio en la pendiente de las curvas de absorción.
Durante los experimentos se controló la temperatura:
- Al irradiar las soluciones con luz ultravioleta de la lámpara BUV-15, no se observaron cambios de temperatura.
- En los experimentos con la lámpara PRK—7, que tiene una fuerte emisión de calor, la temperatura de las soluciones subió a 40–50°C.
Tal calentamiento solo afectó ligeramente la intensidad del color, lo que se confirma por experimentos en los que soluciones de humatos de sodio se calentaron durante 4 horas en un ultratermostato a temperaturas de 25° a 95°C (Tabla 1). Las temperaturas elevadas redujeron las densidades ópticas de las soluciones, pero no lo suficiente como para atribuir la pérdida de intensidad del color durante la irradiación a este efecto.
| Temperatura, °С | Humatos de sodio, рН 12—13 | Ácidos fúlvicos | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| muestra 1 | muestra 2 | muestra 3 | muestra 3; рН 12 | muestra 3; рН 2,5 | muestra 2; рН 2,5 | |
| 20 | 0,351 | 4 0,572 | 0,765 | 0,510 | 0,294 | 0,214 |
| 40 | 0,340 | 0,560 | 0,750 | 0,508 | 0,306 | 0,216 |
| 60 | 0,334 | 0,560 | 0,741 | 0,489 | 0,380 | 0,218 |
| 80 | 0,327 | 0,548 | 0,725 | 0,482 | 0,398 | 0,238 |
| 95 | 0,316 | 0,508 | 0,737 | 0,466 | 0,408 | 0,253 |
Muestra 1 — preparado de ácido húmico Merck; muestra 2 — suelo podzólico fuertemente césped de la región de Moscú, hor. Ar; muestra 3 — chernozem lixiviado (de montaña), hor.
El uso de radiación ultravioleta no excluye la posibilidad de oxidación de moléculas húmicas bajo la influencia del ozono producido. Para eliminar esta objeción, realizamos una serie de experimentos irradiando una solución acuosa de ácido fúlvico y humato de sodio con una lámpara PRK—7, que emite radiación en las regiones visible y ultravioleta cercana. De la figura 6 se desprende que para dosis iguales de energía absorbida, la densidad óptica de las sustancias húmicas cambia de manera idéntica bajo la acción de la radiación de cualquier longitud de onda estudiada.
Los experimentos confirman que el efecto del ozono, al igual que el calentamiento, puede ser solo un factor acompañante, especialmente considerando que el ozono se forma solo bajo la acción de radiación con una longitud de onda inferior a 280 nm. La radiación en el rango de 300–330 nm promueve la destrucción del ozono, su conversión en oxígeno molecular.
La principal causa del cambio en las características ópticas de las sustancias húmicas durante la irradiación son las **reacciones de fotólisis, la destrucción fotoquímica**. La decoloración de las soluciones de sustancias húmicas durante la irradiación se acompaña, como muestran nuestros experimentos, de un cambio en la distribución de peso molecular de las partículas (Fig. 7).
Las curvas de filtración en gel de los humatos de sodio en Sephadexes tienen dos máximos: A (fracción de alto peso molecular) y B (fracción de bajo peso molecular). Después de la irradiación, aumenta el rendimiento de la fracción B en comparación con A. La comparación de las curvas de elución en el gel también indica una disminución en el peso molecular del ácido húmico después de la irradiación:
- Los máximos en las curvas de elución se desplazan hacia pesos moleculares más bajos.
- El peso molecular promedio en peso de la fracción de bajo peso molecular disminuye después de la irradiación de 13800 a 2975.
- Aparece una nueva fracción C en la curva de elución a través de Sephadex, con un peso molecular de 15600.
La composición de las sustancias húmicas también cambia bajo la acción de la luz, como lo indican los espectros IR (Fig. 8):
- Se observan tendencias hacia un aumento relativo en la intensidad de la banda de 1620–1630 cm⁻¹ en comparación con la banda –COOH (1715 cm⁻¹).
- La absorción en el rango de 1000–1100 cm⁻¹ y 3400 cm⁻¹ también aumenta ligeramente, lo que puede atribuirse a las vibraciones de deformación de los hidroxilos alcohólicos y fenólicos.
Aparentemente, la acción de la luz conduce a cambios significativos en las sustancias húmicas:
- el tamaño de sus moléculas disminuye;
- la oxidabilidad aumenta debido a un aumento en el número de grupos carbonilo (posiblemente quinonas), grupos hidroxilo de alcoholes y fenoles;
- la longitud de las cadenas conjugadas (enlaces C=C) disminuye.
Junto con los procesos enumerados, la iluminación intensa de los ácidos húmicos provoca un fuerte aumento de los **centros paramagnéticos** (radicales libres) en ellos. En nuestros experimentos, la concentración de PMC después de la irradiación de soluciones alcalinas de humatos aumentó de 0,53 a 1,5, con una disminución acompañante en las densidades ópticas.
Cabe destacar que la destrucción fotoquímica de los ácidos húmicos se produce no solo bajo la influencia de fuentes de radiación relativamente potentes. Si la irradiación con lámparas reduce la densidad óptica de los humatos en un 50–70% en 15–20 horas, el mismo efecto se logra en 4–8 meses bajo la luz del día. Los datos experimentales indican consistentemente la destrucción fotoquímica de los ácidos húmicos, que procede como procesos oxidativos con la participación de radicales libres.
El mismo proceso debe ocurrir inevitablemente al extraer sustancias húmicas de los suelos con soluciones alcalinas y en la posterior preparación de preparados húmicos.
Por lo tanto, se puede suponer que durante la preparación de preparados húmicos se produce la **activación de las sustancias húmicas**, que incluye:
- cambio en la conformación de sus moléculas;
- liberación de grupos funcionales;
- descomposición parcial de las fracciones de mayor peso molecular en fragmentos constituyentes con menor PM;
- oxidación parcial con acumulación de grupos carbonilo (posiblemente quinonas);
- aumento de la concentración de centros paramagnéticos.
Las moléculas activadas de esta manera tienen un efecto más energético sobre el desarrollo de las plantas y sus condiciones nutricionales. Los mismos factores: iluminación, temperatura, periodicidad y grado de secado, deben conducir inevitablemente a diferencias en muchas propiedades de los ácidos húmicos de los tipos de suelo zonales.