Fraccionamiento de las sustancias húmicas de la leonardita

Las sustancias húmicas no son compuestos químicamente individuales, sino que representan una mezcla de sustancias de diverso origen, que difieren en peso molecular y estructura química, y al mismo tiempo son más o menos cercanas en sus propiedades. Por lo tanto, aplicando diversas técnicas, se pueden dividir en una serie de fracciones que difieren en propiedades físico-químicas y biológicas.

El fraccionamiento de las sustancias húmicas se realiza: mediante diversos disolventes, por precipitación fraccionada de soluciones con cationes polivalentes a diferentes valores de pH, extrayéndolas de la materia prima con soluciones alcalinas de concentración creciente, mediante el uso de electroforesis y cromatografía, separación en sephadex, etc. La mayoría de los investigadores realizan la separación de sustancias húmicas con el fin de estudiar su estructura, origen y propiedades físico-químicas. Nuestra tarea consiste en estudiar la actividad fisiológica.

Dado que en la mayoría de los casos la primera etapa de la separación de las sustancias húmicas es su extracción de la materia prima (turba, carbón, leonardita, etc.) con la ayuda de algún disolvente, decidimos estudiar primero la actividad fisiológica de las fracciones de leonardita del yacimiento de Zamglayskoye, en la región de Cherníhiv, obtenidas mediante el uso de diferentes disolventes.

Obtuvimos fracciones bencénica, alcohólica, acuosa y alcalina. Esta última se separó en ácidos fúlvicos, ácidos himatomelánicos y ácidos húmicos. Sus características se presentan en la tabla 1.

La actividad fisiológica de las fracciones en una concentración del 0,005% se verificó mediante tres pruebas: se estudió su influencia en el crecimiento de plántulas de cebada, en el incremento de crecimiento de la cebada y en la reproducción de células de levadura. Los resultados de los experimentos se presentan en las tablas 2, 3 y 4.

Analizando los resultados de los experimentos, se puede observar lo siguiente:

• Todas las fracciones de materia orgánica de leonardita tuvieron una influencia notable en el crecimiento de las raíces de cebada. Fue algo más fuerte en la fracción de ácidos húmicos y más débil en los ácidos himatomelánicos.
• La manifestación del efecto estimulante de las fracciones sobre el crecimiento de la masa aérea fue aproximadamente igual y más débil, lo que puede explicarse por la corta duración de los experimentos, que duraron de 10 a 12 días, contando desde el momento de la siembra de las semillas germinadas en las soluciones.
• La actividad auxínica de las fracciones, en comparación con la heteroauxina, es comparativamente pequeña: es algo mayor en los ácidos himatomelánicos y menor en las fracciones bencénica y alcohólica.
• Todas las fracciones ejercieron una acción bastante significativa sobre la reproducción de células de levadura, pero fue especialmente grande en la fracción acuosa y en los ácidos fúlvicos.

La mayor fracción, por contenido en la leonardita y por cantidad en la extracción, es la fracción de ácidos húmicos y fúlvicos. Y dado que estas, según datos preliminares, ejercen la acción reguladora más fuerte sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas superiores, se decidió comenzar un estudio más completo de las sustancias húmicas de la leonardita precisamente con esta fracción.

Para el fraccionamiento de los ácidos húmicos aplicamos dos métodos. Según el primer método, una muestra de leonardita se cubrió con cinco veces su volumen de solución de KOH 0,1 N y se dejó reposar durante un día con agitación constante. Después de la sedimentación, la solución se vertió en una botella y el sedimento se volvió a cubrir con la misma solución alcalina, repitiendo la operación de extracción. Después de 4-5 extracciones, toda la solución se juntó y, mediante el cambio del valor de pH y centrifugación, se separó en ocho fracciones más estrechas. Las condiciones de su aislamiento y sus características se presentan en la tabla 5. Cabe señalar que al disolver las dos primeras fracciones, la solución resulta ligeramente turbia.

La determinación de la actividad fisiológica de las soluciones de las fracciones con una concentración del 0,005%, al igual que en los casos anteriores, se realizó mediante tres pruebas (tablas 6, 7 y 8).

Comparando la acción fisiológica de las fracciones de ácidos húmicos (tabla 6) con la acción de las fracciones de materia orgánica de leonardita mostrada en la tabla 2 sobre el crecimiento de las plántulas de cebada, se puede notar que todas las fracciones influyen aproximadamente igual en el crecimiento de la masa aérea. En cuanto al sistema radicular, dos fracciones de ácidos húmicos (3 y 4), en dos de tres experimentos, ejercieron una influencia más fuerte en su crecimiento que todas las demás, cuya acción fue aproximadamente igual, pero ligeramente inferior a la acción del humato de potasio no fraccionado (estándar). La actividad auxínica de las fracciones de ácidos húmicos, en comparación con la heteroauxina, es insignificante e igual a las fracciones analizadas anteriormente.

La adición al medio Rieder de soluciones de fracciones de ácidos húmicos intensificó drásticamente la reproducción de las levaduras. Esto es especialmente notable en la fracción N.º 8, que por sus propiedades se aproxima a los ácidos fúlvicos. Sin embargo, la mayor actividad la mostró el humato de potasio no fraccionado (estándar). Esto se explica, evidentemente, porque en su composición entran tanto sustancias hidrosolubles como ácidos fúlvicos, que en el experimento anterior (tabla 4) mostraron los mejores resultados.

Sin embargo, no es posible establecer una dependencia de la magnitud de la actividad fisiológica de las fracciones respecto al contenido o cantidad de unos u otros grupos funcionales. Esto se complica no solo porque la actividad de las fracciones cambia con respecto a diferentes pruebas, sino también porque no permanece estable al repetir los experimentos con las mismas pruebas: en unos experimentos la actividad de alguna fracción puede ser mayor que la actividad de otras, mientras que en otros experimentos puede ser algo menor. Con toda probabilidad, la actividad fisiológica de las fracciones de materia orgánica de leonardita depende no tanto de la presencia y cantidad de grupos funcionales, como de la estructura molecular de los compuestos químicos que forman parte de su composición.

Como segundo método de aislamiento de ácidos húmicos utilizamos el método de extracción secuencial de la leonardita con solución de KOH 0,02 N. La leonardita se cubrió con una cantidad de solución alcalina cinco veces su volumen y se dejó reposar durante un día con agitación constante. Después de la sedimentación, la solución se centrifugó durante media hora a 3000 revoluciones por minuto y se vertió en una botella de vidrio, en la cual la fracción extraída de ácidos húmicos se precipitó con ácido clorhídrico. El precipitado obtenido se separó mediante centrifugación y se lavó con agua destilada hasta obtener una reacción neutra de las aguas de lavado, y luego se secó a una temperatura de 40°C.

La leonardita restante se volvió a cubrir con una cantidad de solución alcalina de cinco veces su volumen, de la concentración indicada anteriormente, y se repitió toda la operación de extracción. De esta manera, aislamos 31 fracciones de ácidos húmicos. Su caracterización se presenta en la tabla 9.

De la tabla se desprende que las propiedades físico-químicas de las fracciones no son idénticas. Las primeras fracciones tienen significativamente más grupos ácidos activos y una densidad óptica algo mayor que las últimas.

La actividad fisiológica de las fracciones se comprobó en un experimento con trigo de invierno. Las semillas de trigo se germinaron durante un día y luego se trasplantaron a agua destilada (control) y a soluciones de fracciones de ácidos húmicos con una concentración del 0,003%. Para obtener las soluciones de fracciones de ácidos húmicos con una concentración del 0,003%, una muestra de sustancia seca de la fracción en cantidad de 30 mg (calculado sobre sustancia absolutamente seca y libre de cenizas) se trituró en un mortero con dos mililitros de KOH 0,1 N, y luego se completó con agua destilada hasta un litro.

Las plántulas de trigo se cultivaron en las soluciones durante 10 días. Luego se detuvo el experimento y se determinó la longitud de las raíces y hojas de las plantas, así como su peso fresco y seco.

Según los resultados del experimento (tabla 10), se puede ver que bajo la influencia de las soluciones de fracciones de ácidos húmicos aumentó la longitud de las raíces y hojas, en comparación con el control, así como el peso fresco y seco de las plántulas de trigo. Esto atestigua no solo la intensificación de la división y el crecimiento de las células vegetales, sino también de los procesos de síntesis en ellas. La influencia de las fracciones individuales de ácidos húmicos en el crecimiento de las raíces, las hojas y la acumulación de materia seca por las plántulas de trigo no es idéntica. El aumento de la longitud de las raíces oscila entre el 20 y el 70%, de las hojas entre el 16 y el 32%, y la acumulación de materia seca entre el 7 y el 32%. Pero las diferencias en la fuerza de acción entre las fracciones, a diferencia de las fracciones aisladas mediante el cambio del valor de pH y centrifugación (tabla 6), son pequeñas y al repetir los experimentos, al igual que en los casos descritos anteriormente, no permanecen estables tanto en valor absoluto como en relación entre sí, aunque la propiedad estimulante de las fracciones se conserva en todos los casos.

Se sabe que las soluciones débiles de ácidos húmicos en cualquier condición influyen en el curso de los procesos bioquímicos en las plantas y son reguladores peculiares de su crecimiento y desarrollo. Esto se manifiesta de manera especialmente drástica en presencia de nutrientes, pero en condiciones desfavorables para su asimilación.

Un ejemplo de esto puede ser el experimento que realizamos con tomates de la variedad «Kievskie». El factor desfavorable en este experimento fue el agua destilada con un pH igual a 5,8. La mezcla de nutrientes de Kossovich se preparó con esta misma agua y tenía el mismo valor de pH. Las semillas de tomate se germinaron en agua. Cuatro días después, las semillas germinadas se plantaron en agua destilada, mezcla de Kossovich y soluciones de fracciones de ácidos húmicos, y 10 días más tarde se realizaron mediciones de la longitud de las raíces y tallos y se determinó el peso fresco y seco de las plántulas. Los resultados de los experimentos se presentan en la tabla 11.

Al cultivar plántulas de tomate en agua destilada con pH 5,8, su sistema radicular y su parte aérea estaban fuertemente inhibidos. La adición de diversas fracciones de ácidos húmicos aumentó ligeramente el crecimiento de raíces y tallos, pero el peso seco de las plántulas cambió muy poco debido a la ausencia en las soluciones de los elementos nutritivos necesarios para la síntesis de sustancias proteicas de las células.

Vemos un panorama completamente diferente al cultivar plántulas de tomate en la mezcla nutritiva de Kossovich con la adición de soluciones de fracciones de ácidos húmicos, a pesar de que el valor de pH en las soluciones no cambió y permaneció igual al pH del agua destilada. Si en la mezcla de Kossovich el crecimiento de raíces, tallos y materia seca aumentó insignificantemente en comparación con el agua destilada, al agregar ácidos húmicos a la mezcla no solo se intensificó drásticamente el crecimiento de raíces y tallos, sino que también aumentó significativamente la acumulación de materia seca por las plántulas.

Por lo tanto, se puede concluir que las fracciones de materia orgánica de leonardita poseen propiedades estimulantes. El carácter y la fuerza de la acción de las fracciones depende tanto de la estructura molecular de las sustancias que forman parte de su composición, y de las características del organismo sobre el que actúan, como de las condiciones del medio ambiente. La fuerza de su acción aumenta en condiciones desfavorables y disminuye en las favorables. Al aplicar los métodos de separación correspondientes, parece posible obtener fracciones más estrechas o incluso compuestos individuales que posean una actividad fisiológica específica.