Separación de humatos en ácidos húmicos y fúlvicos en sus fracciones y su actividad biológica.

Con base en las investigaciones, se ha establecido firmemente que las principales unidades estructurales de la molécula de ácido húmico están unidas entre sí por enlaces éter simples. Este último puede hidrolizarse.

Como resultado de la hidrólisis, como ahora se cree comúnmente, la molécula de ácido húmico se descompone en sus elementos estructurales constituyentes. Las sustancias de la serie alifática, que representan la parte periférica del ácido, unidas al núcleo por enlaces éter simples, pasan a la solución. Los núcleos de los ácidos húmicos, según la mayoría de los investigadores, no están sujetos a hidrólisis y por tanto, liberados de cadenas periféricas, deberían permanecer en el sedimento.

En nuestro estudio, aprovechamos esta disposición y aislamos fracciones individuales de ácidos húmicos de acuerdo con el esquema que se muestra en la Fig. 1.

Metodología de la investigación

La preparación seca de humato , que posteriormente fue sometida a hidrólisis, se obtuvo a partir de turba. Los ácidos húmicos y fúlvicos se extrajeron de la turba hirviéndola con NaOH al 3%, después de lo cual se precipitaron con HCl al 10%. El gel de ácido húmico se recogió en un filtro, se lavó con agua hasta obtener una prueba de cloro negativa, luego se volvió a precipitar, se secó a una temperatura de 45-60 °C, se molió en polvo y se utilizó en experimentos en esta forma.

La hidrólisis del ácido húmico se realizó del mismo modo que se hace habitualmente para las proteínas. Se colocó una muestra de 1 g de ácido en un tubo de ensayo, se llenó con 10 ml de HCl 6 N, se selló el tubo de ensayo y se colocó en un horno de secado durante 6 horas a una temperatura de 125-130°C.

Limpieza de fracciones

Después de la hidrólisis, los productos de descomposición se extrajeron de la ampolla. Los núcleos de ácido húmico (residuo después de la hidrólisis) se separaron del hidrolizado mediante filtración. Dado que ambas fracciones contenían mucho cloro y se suponía que iban a ser analizadas en un experimento en maceta, fue necesario realizar una purificación preliminar. El método de purificación fue diferente para las fracciones obtenidas.

Facción No. 1

El residuo después de la hidrólisis, que, a diferencia del ácido húmico original, era completamente negro y poco soluble en álcali, se lavó en un filtro hasta obtener una prueba negativa para cloro. Posteriormente se preparó humato de sodio. Para 100 mg de residuo no hidrolizable, se tomaron 2 ml de NaOH 0,1 N. En forma de tal compuesto, esta fracción se utilizó en el experimento y, según nuestra suposición, caracterizó las propiedades fisiológicas del núcleo de ácido húmico.

Fracciones #2 y #3

La purificación del hidrolizado del ácido clorhídrico resultó más difícil. Probamos un método conocido en la literatura para purificar el hidrolizado del cloro mediante evaporación repetida al vacío (fracción No. 2). Sin embargo, como algunas de las sales minerales pasaron al hidrolizado, dando lugar a la formación de cloruros, resultó imposible eliminar completamente el cloro. Por lo tanto, también se probaron otros métodos de limpieza y se descubrió que eran más preferibles. Una de ellas es la diálisis del hidrolizado en una bolsa de celofán contra corriente de agua hasta que la muestra de cloro desaparece del agua de lavado. Después de la diálisis, en la bolsa que se utilizó en el experimento quedó una solución coloreada (fracción nº 3) y un pequeño sedimento, que fue retirado. El sedimento fue especialmente visible cuando el hidrolizado se neutralizó con hidróxido de sodio antes de la diálisis (fracción nº 3-a).

Separación cromatográfica

Un enfoque original para estudiar la composición de sustancias humáticas es su separación cromatográfica sobre carbón activado seguida de la elución de los compuestos adsorbidos con diversos disolventes. Este método para estas sustancias fue propuesto por primera vez por Forsyth (1947) y luego utilizado con éxito por Dragunov y Khan.

Más tarde aparecieron los trabajos de Drozdova, que desarrolló un método para purificar los ácidos fúlvicos mediante fraccionamiento en carbón. Utilizamos esta técnica, considerando que la purificación de ácidos fúlvicos de una solución ácida y la purificación de un hidrolizado ácido tienen mucho en común. El hidrolizado, al igual que los ácidos fúlvicos, tiene un color naranja y es soluble en álcalis y ácidos. Durante la neutralización, en el punto de transición de color, el congorot forma parcialmente un precipitado, el cual, tras una mayor alcalinización o acidificación, pasa nuevamente a solución.

Fracciones #4, #5 y #6

También se transfieren al hidrolizado de ácido húmico compuestos de naturaleza no aromática, como aminoácidos, aminoazúcares, alcoholes de azúcar, carbohidratos, ácidos urónicos, etc., cuya actividad también fue necesaria probar. Utilizando el método Forsythe modificado por Drozdova, fue posible separar el hidrolizado en al menos dos fracciones y estudiar cada una de ellas por separado.

Para ello, el hidrolizado se pasó a través de una capa de carbón activado. La solución que pasaba a través del carbón era incolora y contenía, según Drozdova, sales inorgánicas, ácido clorhídrico, aminoácidos, bases nitrogenadas, carbohidratos simples, etc. Esta solución, en la medida de lo posible, se espesó y se purificó de cloro al vacío y luego se introdujo en el experimento (fracción nº 4). Las sustancias coloreadas del hidrolizado, adsorbidas en el carbón, se eliminaron con una mezcla de acetona y álcali. Luego se destiló acetona del eluido, el residuo se dializó en una bolsa de celofán hasta que el agua de lavado fue negativa para fenolftaleína y se utilizó en el experimento (fracción No. 5). Esta fracción tenía un color amarillo limón en un ambiente ácido y un color naranja en un ambiente alcalino. Por analogía con la purificación de ácidos fúlvicos, se puede suponer que la fracción adsorbida sobre el carbón contiene una sustancia de naturaleza quinoide, ya que no dio una reacción positiva con α-naftol, reactivo de Millon y cloruro férrico, sino que cambió de color dependiendo de la reacción del medio y tenía un fuerte olor parecido al cloro.

Cabe señalar que, para evitar posibles pérdidas durante la desorción y la diálisis, la fracción especificada del hidrolizado también se probó directamente en forma adsorbida sobre carbón. En este caso, después de pasar el hidrolizado a través del mismo, el carbón activado fue lavado del cloro, se secó, se trituró y se utilizó en el experimento (fracción No. 6).

Resultados de la investigación

Se estudió la actividad biológica de las fracciones obtenidas por el método antes mencionado y del ácido húmico original en forma de humato de potasio en cultivos acuáticos. Se utilizó agua destilada como control.

Se añadieron de 4 a 6 mg de preparaciones de ácido húmico a un recipiente de 0,5 litros. Sobre la misma base se introdujeron sustancias adsorbidas sobre carbón activado. La Tabla 1 muestra el efecto de diferentes fracciones de ácido húmico en el crecimiento de las raíces de cebada, trigo y tomates.

Estos datos indican que los fragmentos de moléculas de ácido húmico son biológicamente activos. El humato de potasio preparado a partir de residuos no hidrolizables no es inferior a una solución de humato de potasio estándar para estimular el crecimiento de las raíces. Por lo tanto, el núcleo de ácido húmico obviamente juega un papel importante en la estimulación del crecimiento de las raíces. Al mismo tiempo, el experimento también detecta una estimulación bastante fuerte por parte de sustancias que, tras la hidrólisis, se adsorben en el carbono. Si tenemos en cuenta que estas sustancias son compuestos polifenólicos y quinónicos, entonces el efecto obtenido en el experimento puede explicarse por su influencia directa sobre la planta.

También hemos observado que el propio carbón activado, como adsorbente, también provoca un mayor crecimiento de las raíces. Algunos investigadores explican este efecto por la capacidad del carbón de adsorber iones de hidrógeno liberados por el sistema radicular, por lo que el carbón promueve el proceso de respiración y nutrición mineral de las plantas. P. A. Vlasyuk, por ejemplo, recomienda añadir lignito a las hileras como adsorbente, lo que reduce la concentración de sales en la zona de las raíces y mejora la nutrición de los cultivos.

Por lo tanto, en el experimento con tomates utilizamos carbón activado, que fue lavado con ácido clorhídrico fuerte antes del experimento, luego se lavó del cloro, una parte se utilizó para la adsorción del hidrolizado y la otra parte se introdujo en el experimento en forma pura. Al comparar la longitud del crecimiento de las raíces de trigo, cebada y tomate, se puede observar que el carbón activado contiene impurezas que pueden distorsionar los resultados del estudio, ya que promueven el crecimiento de las raíces. La sustancia adsorbida sobre el carbono en este caso también resulta biológicamente activa.

De este experimento también se puede convencer que el ácido húmico en forma de gel finamente molido no proporciona ningún efecto como adsorbente. Estos adsorbentes en realidad tienen propiedades diferentes, ya que tienen diferentes capacidades de absorción (Tabla 2).

Una comparación de las capacidades de absorción del carbono y del gel de ácido húmico muestra que si el efecto positivo del carbono sobre el crecimiento de las raíces en nuestros experimentos se explicara por la capacidad de adsorción, el gel de ácido húmico también habría sido eficaz, mientras que, de hecho, incluso inhibió ligeramente el crecimiento de las raíces.

A continuación (Tabla 3) se presentan los resultados de un experimento en el que se probaron las fracciones de ácido húmico después de la desorción del carbón activado.

Conclusiones

De estos experimentos se desprende que la mezcla de productos de hidrólisis (fracción nº 2) es más activa que la fracción de sustancias que no está adsorbida en el carbono y que presumiblemente incluye las cadenas periféricas de los ácidos húmicos. Por tanto, la actividad biológica de los ácidos húmicos depende obviamente de la fracción que se adsorbe al carbono y que, según una serie de características, presenta una estructura polifenólica.

La neutralización previa del hidrolizado con álcali antes de la diálisis conduce a una disminución del efecto estimulante, aparentemente debido al hecho de que, como resultado de la neutralización, las sustancias activas pasan al sedimento, que se elimina después de la diálisis.