Фракціонування гумусових речовин леонардиту

Гумусові речовини не є хімічно індивідуальними сполуками, а являють собою суміш речовин різного походження, що розрізняються за молекулярною вагою і хімічною будовою, і в той же час більш-менш близькі за своїми властивостями. Тому, застосовуючи різноманітні прийоми, їх можна розділити на ряд фракцій, що відрізняються за фізико-хімічними та біологічними властивостями.

Фракціонування гумусових речовин проводять: за допомогою різних розчинників, шляхом дробового осадження з розчинів полівалентними катіонами при різних значеннях pH, витяганням їх з вихідної сировини лужними розчинами зростаючої концентрації, застосуванням електрофорезу і хроматографії, розділенням на сефадексах тощо. Більшість дослідників проводять розділення гумусових речовин з метою вивчення їх будови, походження та фізико-хімічних властивостей. У наше завдання входить вивчення фізіологічної активності.

Оскільки в більшості випадків першою стадією розділення гумусових речовин є їх вилучення із сировини (торфу, вугілля, леонардиту тощо) за допомогою будь-якого розчинника, то ми вирішили спочатку вивчити фізіологічну активність фракцій леонардиту Замглайського родовища Чернігівської області, отриманих при застосуванні різних розчинників.

Нами були отримані бензольна, спиртова, водна і лужна фракції. Остання була розділена на фульвокислоти, гіматомеланові кислоти і гумінові кислоти. Характеристика їх наведена в таблиці 1.

Фізіологічна активність фракцій у концентрації 0,005% перевірялася за трьома тестами: вивчався вплив їх на ріст проростків ячменю, на приріст ячменю і розмноження клітин дріжджів. Результати дослідів наведені в таблицях 2, 3 і 4.

Аналізуючи результати дослідів, можна зазначити наступне:

• Всі фракції органічної речовини леонардиту мали помітний вплив на ріст коренів ячменю. Дещо сильнішим він був у фракції гумінових кислот і слабшим у гіматомеланових кислот.
• Прояв стимулюючої дії фракцій на ріст надземної маси був приблизно рівним і більш слабким, що можна пояснити короткостроковістю дослідів, які тривали 10—12 днів, рахуючи з моменту посадки пророслого насіння на розчини.
• Ауксинова активність фракцій, порівняно з гетероауксином, порівняно невелика: вона дещо вища у гіматомеланових кислот і нижча у бензольної та спиртової фракцій.
• Всі фракції мали досить значну дію на розмноження клітин дріжджів, але особливо великою вона є у водної фракції та фульвокислот.

Найбільшою, за вмістом у леонардиті та за кількістю при вилученні, є фракція гумінових і фульвових кислот. А оскільки вони ж, за попередніми даними, мають найбільш сильну регулюючу дію на ріст і розвиток вищих рослин, то саме з цієї фракції і було вирішено почати більш повне вивчення гумусових речовин леонардиту.

Для фракціонування гумінових кислот ми застосували два методи. За першим методом наважка леонардиту заливалася п'ятикратним за обсягом 0,1 н розчином KOH і настоювалася протягом доби при постійному перемішуванні. Після відстоювання розчин зливався в бутель, а осад знову заливався таким же розчином лугу і операція вилучення повторювалася. Після 4—5-кратного вилучення весь розчин був злитий разом і за допомогою зміни величини pH і центрифугування був розділений на вісім вужчих фракцій. Умови їх виділення і характеристика наведені в таблиці 5. Слід зазначити, що при розчиненні перших двох фракцій розчин виходить злегка каламутним.

Визначення фізіологічної активності розчинів фракцій концентрацією 0,005%, так само як і в попередніх випадках, проводилося за трьома тестами (таблиці 6, 7 і 8).

Порівнюючи фізіологічну дію фракцій гумінових кислот (табл. 6) з дією фракцій органічної речовини леонардиту, наведеною в табл. 2, на ріст проростків ячменю, можна зазначити, що на ріст надземної маси всі фракції впливають приблизно однаково. Що ж стосується кореневої системи, то дві фракції гумінових кислот (3 і 4), у двох дослідах із трьох, мали сильніший вплив на її ріст, ніж усі інші, дія яких була приблизно рівною, але трохи нижчою за дію нерозфракціонованого гумату калію (стандарт). Ауксинова активність фракцій гумінових кислот, порівняно з гетероауксином, незначна і дорівнює розглянутим вище фракціям.

Додавання до середовища Рідер розчинів фракцій гумінових кислот різко посилило розмноження дріжджів. Особливо це помітно у фракції № 8, яка за своїми властивостями наближається до фульвокислот. Однак найбільшу активність проявив нерозфракціонований гумат калію (стандарт). Це, очевидно, пояснюється тим, що до його складу входять і водорозчинні речовини, і фульвокислоти, які в попередньому досліді (табл. 4) показали найкращі результати.

Однак встановити залежність величини фізіологічної активності фракцій від вмісту або кількості тих чи інших функціональних груп не представляється можливим. Це ускладнюється не тільки тим, що активність фракцій змінюється по відношенню до різних тестів, але й тим, що вона не залишається стабільною при повторенні дослідів з одними і тими ж тестами: в одних дослідах активність якоїсь фракції може бути вищою, ніж активність інших, в інших же дослідах — дещо нижчою. Цілком ймовірно, що фізіологічна активність фракцій органічної речовини леонардиту залежить не стільки від наявності та кількості функціональних груп, скільки від молекулярної структури хімічних сполук, що входять до їх складу.

Як другий метод виділення гумінових кислот ми використали спосіб послідовного вилучення їх з леонардиту 0,02 н розчином KOH. Леонардит заливався п'ятикратною за обсягом кількістю лужного розчину і настоювався протягом доби при постійному перемішуванні. Після відстоювання розчин центрифугувався протягом півгодини при 3000 обертів на хвилину і зливався в скляний бутель, в якому витягнута фракція гумінових кислот осаджувалася соляною кислотою. Отриманий осад за допомогою центрифугування відокремлювався і промивався дистильованою водою до нейтральної реакції промивних вод, а потім висушувався при температурі 40°С.

Леонардит, що залишився, знову заливався п'ятикратною за обсягом кількістю лужного розчину зазначеної вище концентрації, і вся операція вилучення повторювалася. Таким чином, нами була виділена 31 фракція гумінових кислот. Характеристика їх наводиться в таблиці 9.

З таблиці видно, що фізико-хімічні властивості фракцій неоднакові. Перші фракції мають значно більше активних кислих груп і дещо більшу оптичну густину, ніж останні.

Фізіологічна активність фракцій перевірялася в досліді з озимою пшеницею. Насіння пшениці протягом доби пророщувалося, а потім пересаджувалося на дистильовану воду (контроль) і розчини фракцій гумінових кислот концентрацією 0,003%. Для отримання розчинів фракцій гумінових кислот концентрацією 0,003% наважка сухої речовини фракції в кількості 30 мг (у перерахунку на абсолютно суху беззольну речовину) розтиралася в ступці з двома мілілітрами 0,1 н KOH, а потім доводилася дистильованою водою до одного літра.

На розчинах проростки пшениці вирощувалися протягом 10 днів. Потім дослід припинявся і визначалася довжина коренів і листя рослин, а також їх сира і суха вага.

За результатами досліду (табл. 10) можна бачити, що під впливом розчинів фракцій гумінових кислот збільшувалися довжина коренів і листя, порівняно з контролем, а також сира і суха вага проростків пшениці. Це свідчить не тільки про посилення поділу і росту клітин рослин, але й процесів синтезу в них. Вплив окремих фракцій гумінових кислот на ріст коренів, листя і накопичення сухої речовини проростками пшениці не однаковий. Приріст довжини коренів коливається від 20 до 70%, листя — від 16 до 32, накопичення сухої речовини — від 7 до 32%. Але відмінності в силі дії між фракціями, на відміну від фракцій, виділених шляхом зміни величини pH і центрифугування (табл. 6), невеликі і при повторенні дослідів так само, як і в описаних вище випадках, не залишаються стабільними як за абсолютною величиною, так і по відношенню одна до одної, хоча стимулююча властивість фракцій у всіх випадках зберігається.

Відомо, що слабкі розчини гумінових кислот у будь-яких умовах впливають на хід біохімічних процесів у рослинах і є своєрідними регуляторами їх росту і розвитку. Особливо ж різко це проявляється за наявності поживних речовин, але в умовах, несприятливих для їх засвоєння.

Прикладом цього може служити дослід, поставлений нами з томатами сорту «Київські». Несприятливим фактором у цьому досліді була дистильована вода з pH рівним 5,8. Поживна суміш Коссовича була приготована на цій же воді і мала ту ж величину pH. Насіння томатів пророщувалося на воді. Через чотири дні насіння, що проклюнулося, було висаджено на дистильовану воду, суміш Коссовича і розчини фракцій гумінових кислот, а ще через 10 днів проведені заміри довжини коренів і стебел і визначена сира і суха вага проростків. Результати дослідів представлені в таблиці 11.

При вирощуванні проростків томатів на дистильованій воді з pH 5,8 їх коренева система і надземна частина були сильно пригнічені. Додавання різних фракцій гумінових кислот дещо збільшило приріст коренів і стебел, але суха вага проростків змінилася дуже мало через відсутність у розчинах необхідних поживних елементів для синтезу білкових речовин клітин.

Зовсім іншу картину ми бачимо при вирощуванні проростків томатів на поживній суміші Коссовича з додаванням до неї розчинів фракцій гумінових кислот, незважаючи на те, що величина pH у розчинах не змінилася і залишалася рівною pH дистильованої води. Якщо на суміші Коссовича приріст коренів, стебел і сухої речовини незначно зросли порівняно з дистильованою водою, то при додаванні до суміші гумінових кислот не тільки різко посилився ріст коренів і стебел, але й значно збільшилося накопичення сухої речовини проростками.

Таким чином, можна зробити висновок, що фракції органічної речовини леонардиту мають стимулюючі властивості. Характер і сила дії фракцій залежить як від молекулярної структури речовин, що входять до їх складу, і особливостей організму, на який вони діють, так і від умов зовнішнього середовища. Сила їх дії збільшується за несприятливих умов і зменшується за сприятливих. При застосуванні відповідних методів розділення представляється можливим отримання вужчих фракцій або навіть індивідуальних сполук, що володіють специфічною фізіологічною активністю.