Про природу фізіологічної активності гуматів
Вплив фізіологічно активних форм гумінових кислот та споріднених з ними сполук, наприклад поліфенолів, на оксидативний обмін можна вважати твердо встановленим фактом. Пояснення цьому явищу різні дослідники дають різне. Ми ж протягом багатьох років висловлювали думку, що головне тут полягає в тому, що хінонні групи цих сполук, будучи переносниками водню від об’єкта окислення до кисню, посилюють найважливішу транспортну систему передачі електронів і, таким чином, усувають кисневий дефіцит у клітинах, який, як показують спостереження, виникає частіше, ніж прийнято думати. Все це призводить до підвищення енергетичного потенціалу рослин, що експериментально підтверджується вимірюванням біоелектричного потенціалу — БЕП, показниками термодинамічного стану рослин і позитивно позначається на обміні речовин у організмі.
Одним із найсміливіших біохіміків Сент-Дьйорді висловлював ідею, що всі біохімічні процеси — це поступовий спуск електрона, піднятого на вищий рівень внаслідок поглинання кванта світла під час фотосинтезу. Бернар і Альберта Пюльмани, у свою чергу, говорили: «Динамічність життя узгоджується з динамічністю електронної хмари в спряжених молекулах...». Головною особливістю цих молекул вони вважали наявність у них делокалізованих електронів, які надають молекулі додаткову стабільність, стійкість до випромінювань, можливість передачі електронного збудження на великі відстані, можливість перенесення електрона та енергії тощо.
Делокалізовані або неспарені електрони набули такого значення тому, що вони збуджуються легше, ніж спарені. Збудження електрона, тобто перенесення його з нижчого енергетичного рівня на вищий, визначається поглинанням кванта видимого або ультрафіолетового світла. Зворотний процес супроводжується виділенням кванта і світінням, тобто люмінесценцією. Такий перенесення електрона ніби відповідає внутрішньомолекулярному рівню окисно-відновних процесів. Міжмолекулярний перенесення делокалізованого електрона пов’язаний вже з окисно-відновними процесами на міжмолекулярному рівні, тобто з диханням. Цілком очевидно, що обидва ці процеси взаємопов’язані, і оскільки вплив гумінових і фульвових кислот на процеси дихання — факт, твердо встановлений, можна припускати, що вони впливають і на збудження електрона.
Є підстави вважати, що фізіологічно активні форми гумінових і фульвових кислот, потрапивши до рослин, впливають на налаштування енергетичних рівнів делокалізованих електронів спряжених молекул і, таким чином, торкаються найважливіших життєвих процесів. Якщо це припущення правильне, то, по-перше, фізіологічно активні гумати повинні сприяти кращому поглинанню сонячної енергії, причому їх ефективність у різних променях спектру повинна бути різною; по-друге, вони повинні впливати на парамагнітні властивості рослинних тканин; по-третє, під впливом гуматів мають посилюватися їх люмінесцентні властивості. Не ставлячи за мету виявити кількісну сторону цих процесів і розкрити його механізм, ми здійснили це дослідження лише для того, щоб експериментально перевірити висловлене припущення.
Методика досліджень
Для вирішення поставлених завдань проводили короткострокові мікровегетаційні досліди в умовах різного спектру. Методика дослідів така: насіння кукурузи та машу поміщали у пророщувачі, замочували розчинами згідно зі схемою досліду і ставили у темний термостат. Потім п’яти-, семиденні етіольовані паростки пересаджували у склянки місткістю 500 мл по 5 рослин у кожну, на середовище відповідно до схеми досліду і поміщали під світлову установку у відсіки з різними кольоровими екранами. Освітлювалася установка лампами денного світла 3500 лк/м². Екрани готували шляхом нанесення кольорових плівок, отриманих за методом Гродзинського, на скло розміром 36 × 48 см. Їх спектральну характеристику визначали на СФ-4А.
У схему досліду включали гумат калію, який випробовували у концентраціях 3.1⋅10⁻⁵ моль/л і АТФ — 1.4⋅10⁻⁵ моль/л (остання як додатковий контроль як сполука, багата енергією). Середовищем була або збіднена суміш Прянишникова, у якій фосфор давали у вигляді буферної солі Серенсена, або дистильована вода. Дослід закладали у трикратній повторності. Він тривав протягом 7 днів, після чого рослини вимірювали, зважували і аналізували за такими показниками: хлорофіл за Гетрі, нуклеїнові речовини за методом Нетуцької та Курамшина. Було закладено 27 таких дослідів.
Для з’ясування питання — чи впливають розчинні гумати на парамагнітні властивості рослинних тканин — був використаний метод електронного парамагнітного резонансу (ЕПР). Як відомо, сутність методу ЕПР полягає у резонансному поглинанні високочастотної електромагнітної енергії об’єктом при строго певних співвідношеннях напруженості магнітного поля та частоти. Метод ЕПР ґрунтується на відомому ефекті Зеемана, який полягає в тому, що при введенні парамагнітної частинки, яка характеризується наявністю неспареного електрона та квантовим спіновим числом S, постійне магнітне поле її основний енергетичний рівень розщеплюється на 2S+1 підрівнів, які відокремлені один від одного проміжками енергії:
ΔE=hν=gbH, де H — напруженість магнітного поля, ν — частота.
При подачі на парамагнітний зразок, поміщений у постійне магнітне поле «Н» високочастотного (ВЧ або СВЧ) магнітного поля з перпендикулярною до Н орієнтацією магнітного вектора, при частоті:
ν=hΔE=hgbH
з однаковою ймовірністю індукуються переходи між двома сусідніми рівнями, де:
- g — фактор спектроскопічного розщеплення;
- b — магнетон Бора;
- h — стала Планка.
При цьому відбувається перерозподіл населеності енергетичних рівнів у бік їх вирівнювання, частина енергії СВЧ поля поглинається у зразку і витрачається на його нагрівання. Завданням досліду при спостереженні явища ЕПР є точна реєстрація поглиненої зразком високочастотної енергії. Багато вчених вивчали явище електронного парамагнітного резонансу у цілому ряді біологічно активних сполук і в живих тканинах і показали його ефективність для цієї мети.
Як об’єкт наших досліджень брали листя та корені п’яти-, шестиденних паростків машу, вирощених у певних умовах, і піддавали їх ліофільної сушці після заморожування до температури −70°. Сушили їх протягом 24 годин до залишкового тиску 10⁻³ мм рт. ст. Для дослідження ЕПР наважки висушених листя та коренів у 3-5 мг поміщали у тонкостінні кварцові трубки діаметром 4-5 см, які відпалювали у ацетилено-кисневому полум’ї. Спектри ЕПР реєстрували у вигляді першої похідної кривої резонансного поглинання. Вміст вільних радикалів у зразку визначали порівнянням еталону та площ під інтегральними кривими резонансного поглинання досліджуваної речовини, які будували за диференціальними кривими I′=f(H) при ν=const. Площі розраховували методом подвійного графічного інтегрування. Як еталон для вимірювання ширини ліній досліджуваних спектрів слугував γ-опромінений аланін, а при визначенні площ — γ-опромінена сахароза. Для визначення g-фактора використовували вакуумовані трубки з еталоном Mn++ у MgO, для яких точно відомі значення g-фактора. Для наближених розрахунків площ під інтегральними кривими користувалися формулами Сімпсона.
Для того щоб констатувати вплив гумінової кислоти на люмінесценцію рослин, вирощених у різних умовах спектру, поступали таким чином: наважку тканини листя розтирали з водою у співвідношенні 2:100 і залишали на деякий час. Потім до певного об’єму відфільтрованого витягу додавали по 1 мл флуоресцину 10⁻³ моль/л, опромінювали ультрафіолетовим світлом (скло Вуда) протягом 5 хв, після чого визначали відносну інтенсивність флуоресценції.
Результати досліджень
Насамперед проаналізуємо найхарактерніші дані, які показують вплив гумінових кислот та АТФ на накопичення сирої маси у різних променях спектру. Вони показують, що накопичення сирої маси у паростках кукурузи було максимальним у червоно-оранжевій та синьо-фіолетовій частині спектру, мінімальним — у зеленій частині. Аналогічною була і реакція рослин на фізіологічно активні форми гумінових кислот та АТФ.
Неважко побачити, що реакція паростків кукурузи на фізіологічно активні речовини за утворенням сирої маси повторює криву поглинання світла хлорофілом, що дає підстави думати, що фізіологічно активні речовини впливають на фотохімічні реакції фотосинтезу і сприяють кращому поглинанню енергії сонця. Цей дослід повторювали багаторазово, і він давав близькі результати з деяким зміщенням максимуму накопичення маси усередині фіолетової частини спектру. Маш виявився у цьому відношенні менш чутливим.
Вплив фізіологічно активних речовин позначається не лише на утворенні сирої маси, але й на морфогенезі рослин, причому він відрізняється від впливу на вагу. Виявилося, що корені відносно краще реагують на гумати у синьо-фіолетовій ділянці спектру, а листя — у червоно-оранжевій.
Спостереження за впливом досліджуваних факторів на вміст хлорофілу показали, що максимум реакції у кукурузи у цьому відношенні зміщується від короткохвильової частини спектру до довгохвильової. В окремих випадках пік виходить у жовто-зеленій частині спектру. Реакція рослин на зміну спектрального складу за кількістю хлорофілу досить постійна і більше пов’язана з інтенсивністю світла. Спостереження за вмістом нуклеїнових кислот показують, що дія фізіологічно активних речовин при різній якості світла, безперечно, впливає на цей апарат рослинної клітини. Однак суперечливість даних у різних дослідах не дозволяє ще встановити напрямок цього процесу.
Дані вимірювань ЕПР та відповідні розрахунки представлені в таблицях 1 і 2. Ці дані показують, що ЕПР рослинних тканин машу, підданих ліофільної сушці, представлені одиночними лініями з g-фактором, близьким до g-фактора вільного електрона (для листя gсер. дорівнює 2.00388±0.0005 і ΔHсер.−18.1±0.2 е; для коренів gсер.−2.00349±0.0005 і ΔHсер.−13.5±0.2 е).
| Показники | Насіння пророщено на | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Воді | Гуматі калію | АТФ | 2,4-ДНФ | |||
| Паростки пересаджено на | Воду | Гумат калію | АТФ | 2,4-ДНФ | ||
| ΔН е | 15,9 | 18,2 | 16,4 | 19,0 | ||
| g-фактор | 2,00441 | 2,00279 | 2,00489 | 2,00438 | ||
| S-інтегральне (мм²) | 150 | 220 | 120 | 175 | ||
| Примітка. Для еталону γ-сахарози, що містить 10¹⁷ спінів/г, S-інтегральне дорівнює 455 мм². | ||||||
| Показники | Насіння пророщено на | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| воді | гуматі калію | АТФ | 2,4-ДНФ | |||
| Паростки пересаджено на | воду | гумат калію | АТФ | 2,4-ДНФ | ||
| ΔН е | 11,2 | 14,5 | 16,3 | 9,6 | ||
| g-фактор | 2,00461 | 2,00440 | 2,00473 | 2,00380 | ||
| S-інтегральне (мм²) | 20 | 40 | 60 | 12 | ||
Зі зіставлення диференціальних кривих випливає, що гумати калію та АТФ збільшують амплітуду сигналу ЕПР, а 2,4-динітрофенол його гасить. Дуже важливо, що додаткова пересадка рослин з цього інгібітора на фізіологічно активні речовини певною мірою відновлює сигнал ЕПР, що корелює з фізіологічною реакцією рослин на ці речовини. Аналогічним був їхній вплив і на інтегральну криву, що дозволяє говорити про збільшення кількості вільних радикалів під впливом фізіологічно активних речовин. Важливо відзначити також, що кількість вільних радикалів у листі була набагато більшою, ніж у коренях.
Фізіологічну дію гумінових кислот потрібно пов’язувати з наявністю у них вільних радикалів. Наявність вільних радикалів у гумінових кислотах ґрунту методом ЕПР була пізніше показана роботами у нашій лабораторії.
Ступінь люмінесценції витяжок із рослин, вирощених у різних променях спектру і отримали, і не отримали фізіологічно активні речовини, коливається. Намітилася тенденція до збільшення ефекту у цьому відношенні від гуматів калію у червоно-оранжевій частині спектру. Вплив АТФ залишився нез’ясованим.
Висновки
- Отримані результати насамперед показують, що реакція рослин на фізіологічно активні форми гуматів у різних променях спектру неоднакова: вона більша у червоно-оранжевій та синьо-фіолетовій частині, тобто у тій частині спектру, яка краще поглинається хлорофілом.
- Визначення сигналу ЕПР у тканинах машу показало, що під впливом фізіологічно активних речовин у них збільшується кількість парамагнітних центрів.
- Наведені вище факти, а також зміна інтенсивності люмінесценції витяжок із рослин за присутності флуоресцину дозволяють припустити, що фізіологічно активні гумати сприяють поглинанню квантів світла і впливають на налаштування енергетичного рівня делокалізованих електронів спряжених молекул, що входять до складу тканин рослин.