Fotoliza i Deformacja Substancji Humusowych pod Wpływem Światła, Wilgotności i Temperatury
Pozytywne, a w niektórych przypadkach i negatywne, działanie substancji humusowych, w tym preparatów huminowych, na warunki odżywiania i rozwoju roślin zostało ustalone przez wielu badaczy. Natura zjawiska i mechanizm interakcji kwasów huminowych z roślinami są dyskusyjne, ale niezależnie od tego, kluczowe znaczenie ma pytanie: dlaczego stosunkowo małe dawki nawozów huminowych mogą być skuteczne na glebach, które zawierają znacznie wyższe ilości tych samych substancji.
Ogólną odpowiedź na to pytanie daje analogia z pojęciem dostępności dla roślin elementów odżywiania mineralnego i azotu. W odniesieniu do kwasów huminowych to pojęcie jest znacznie szersze i obejmuje, oczywiście:
- ich ruchliwość (rozpuszczalność) w glebach;
- interakcję ze składnikami mineralnymi;
- rozmiary i konfigurację molekuł;
- jakość samych molekuł: zawartość grup funkcyjnych, centrów paramagnetycznych itp.
Dlatego, charakteryzując fizjologiczne działanie substancji humusowych, słuszniej jest mówić nie o dostępności, a o ich **aktywności** lub o aktywnych składnikach humusu.
Jedna z przyczyn podwyższonej aktywności preparatów huminowych, w porównaniu z naturalnymi kwasami huminowymi gleb, polega, naszym zdaniem, na zmianach, które w nich zachodzą w trakcie przygotowania preparatów. Oprócz zniszczenia wiązań organo-mineralnych, oddziaływanie roztworów alkalicznych i innych czynników może powodować:
- hydrolizę kwasów humusowych, ich utlenianie;
- zmianę charakteru rozkładu mas molekularnych cząstek;
- zmianę konfiguracji i konformacji molekuł.
Zjawiska tego rodzaju, które nie zmieniają przynależności związków do klasy kwasów humusowych, ale wpływają na szczegóły budowy, można połączyć terminem «**denaturacja**», rozumiejąc ją w szerszym sensie niż ma to miejsce w chemii białek. Zbadaliśmy niektóre z procesów denaturacji kwasów huminowych zachodzących pod wpływem ich suszenia, ogrzewania i naświetlania.
Deformacja Molekuł Kwasów Huminowych pod Wpływem Wilgotności i Suszenia
Różnice w konfiguracji molekuł humatów i kwasów huminowych w stanie wilgotnym (rozpuszczonym) i w postaci suchej są wyraźnie widoczne podczas pomiaru gęstości względnych. Zmniejszenie objętości molowych białek podczas rozpuszczania w wodzie jest dobrze znane. Suche kwasy huminowe są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie, dlatego mierzyliśmy ich gęstość najpierw w wodzie («suchy preparat»), a następnie w słabych roztworach KOH.
W rozcieńczonych roztworach KOH objętości właściwe kwasów huminowych maleją, a gęstości rosną wraz ze wzrostem stężenia zasady (rys. 1). Przy dalszym zwiększaniu stężenia zasady, gdy praktycznie całkowicie neutralizowane są wszystkie grupy karboksylowe i wszystkie lub większość grup fenolowych, gęstość maleje, osiągając wartości mniejsze niż w stanie suchym.
Taką zmianę gęstości można wytłumaczyć tym, że suche preparaty kwasów huminowych są mało hydrofilowe, a wprowadzenie niewielkiej ilości zasady gwałtownie zmienia stan substancji. Pojawienie się ładunków ujemnych na skutek utworzenia jonów karboksylanowych wywołuje rozpuszczenie części preparatu. Molekuły wody orientują się i zagęszczają w pobliżu grup jonogennych, co pociąga za sobą pozorne zmniejszenie objętości właściwej; mierzona wartość gęstości wzrasta. Wiązanie wody jest potwierdzone stopniem hydratacji humatów, który według danych wiskozymetrycznych wynosi nie mniej niż 1,2–2,5 g wody na 1 g kwasu huminowego.
Przy dalszej neutralizacji grup karboksylowych pojawia się duża liczba ładunków ujemnych; ich wzajemne odpychanie sprzyja prostowaniu łańcuchów molekuły i substancja dąży do zajęcia większej objętości niż w stanie suchym. Podobne zjawisko jest znane dla RNA, którego molekuła przyjmuje sztywną strukturę «kija» pod wpływem elektrostatycznego odpychania sąsiednich grup zjonizowanych. Zgodnie z tymi założeniami, ułożenie kwasów huminowych i stopień zorientowania molekuł nie mogą być jednakowe w stanie suchym i w żelu. W żelach («spęczniałych» preparatach) molekuły kwasów huminowych powinny być rozmieszczone bardziej uporządkowanie niż w suchych preparatach.
Aby sprawdzić to ostatnie założenie, otrzymaliśmy dyfraktogramy żeli niektórych kwasów huminowych, a następnie dyfraktogramy tych samych próbek po ich wysuszeniu na powietrzu. Suche preparaty kwasów huminowych nie mają wyraźnych refleksów; obraz dyfrakcyjny jest rozmyty, intensywność odbić jest niewielka: jej maksimum przypada na obszar 3,5–3,7 Å (rys. 2).
Intensywności odbić w żelach gwałtownie wzrastają, a dyfraktogramy pod względem charakteru rozkładu intensywności odbicia nieco różnią się od preparatów suchych (rys. 2). Wzrost intensywności odbić jest niewątpliwie spowodowany większym uporządkowaniem rozmieszczenia molekuł. Uporządkowaniu w stanie suchym przeszkadzają zarówno polidyspersyjność, jak i zdeformowanie molekuł. Maksimum intensywności przesuwa się z 3,5–3,7 Å do 3,3–3,1 Å, co pozwala sądzić o większej podatności na deformację elementów struktury z większymi okresami powtarzalności.
Na deformowalność molekuł kwasów huminowych wskazują również inne dane. Zwykle zdjęcia mikroskopii elektronowej świadczą o zaokrąglonym kształcie cząstek kwasów huminowych. Jednakże, oznaczenia wiskozymetryczne wskazują na elipsoidalną konformację cząstek ze stosunkiem osi 1:6. Prawdopodobnie, również przy przejściu z roztworów humatów, stosowanych w wiskozymetrii, do suchych osadów (mikroskopia elektronowa) deformacja molekuł prowadzi do zmiany kształtu cząstek (lub asocjatów) z wydłużonego na zaokrąglony.
Dodatkowym potwierdzeniem deformacji kwasów huminowych i fulwowych podczas suszenia mogą służyć zdjęcia powierzchni suchych preparatów, uzyskane za pomocą mikroskopu skaningowego (rys. 3, 4). Na zdjęciach dobrze widoczna jest warstwowa budowa cząstek. Głębokie pęknięcia i rozłamy wskazują na znaczną deformację molekuł substancji organicznej podczas suszenia.
Uzyskane wyniki pozwalają przypuszczać, że maksymalną aktywność w glebach mają te nowo powstałe kwasy huminowe, których molekuły są najbardziej wyprostowane. Są bardziej ruchliwe, energicznie reagują ze składnikami mineralnymi i organicznymi oraz uczestniczą w tworzeniu struktury. Starzenie się kwasów huminowych, zachodzące w wyniku suszenia, towarzyszy:
- deformacji molekuł;
- utracie rozpuszczalności;
- wewnątrzcząstecznemu blokowaniu części grup funkcyjnych.
Wszystko to prowadzi do obniżenia ich oddziaływania na rośliny.
Fotoliza i Zmiana Składu Mas Molekularnych pod Działaniem Światła
Inne działanie na roztwory kwasów humusowych wywiera światło. W naszych doświadczeniach wykorzystano promieniowanie lamp rtęciowo-kwarcowych BUW—15 (promieniowanie monochromatyczne o długości fali 2537 Å) i PRK—7 (dyskretne spektrum promieniowania w zakresie 312–611 nm). Działaniu światła poddawano roztwory kwasów humusowych, umieszczone w hermetycznie zamkniętych cylindrycznych kuwetach kwarcowych. Rozpuszczalnikami były roztwory wodorotlenku sodu o stężeniu 0,1 N i 0,01 N oraz woda destylowana. Kontrolę nad działaniem światła prowadzono za pomocą elektronicznych widm absorpcji.
We wszystkich wariantach doświadczeń stwierdzono znaczący spadek gęstości optycznej już po 10–15 minutach ciągłego naświetlania, a po 15–25 godzinach w wielu przypadkach roztwory odbarwiły się praktycznie całkowicie (rys. 4). Charakter widm przy tym prawie się nie zmieniał (rys. 5), odnotowano jedynie zmianę nachylenia krzywych absorpcji.
W trakcie doświadczeń prowadzono kontrolę temperatury:
- Przy naświetlaniu roztworów światłem ultrafioletowym lampy BUV-15 nie odnotowano zmian temperatury.
- W doświadczeniach z lampą PRK—7, posiadającą silne promieniowanie cieplne, temperatura roztworów wzrastała do 40–50°C.
Takie ogrzewanie tylko nieznacznie wpływało na intensywność zabarwienia, co potwierdzają doświadczenia, w których roztwory humatów sodu ogrzewano przez 4 godziny w ultratermostacie w temperaturze od 25° do 95°C (Tabela 1). Podwyższone temperatury obniżały gęstości optyczne roztworów, ale nie na tyle, aby można było z tym efektem wiązać utratę intensywności zabarwienia podczas naświetlania.
| Temperatura, °С | Humaty sodu, рН 12—13 | Kwasy fulwowe | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| próbka 1 | próbka 2 | próbka 3 | próbka 3; рН 12 | próbka 3; рН 2,5 | próbka 2; рН 2,5 | |
| 20 | 0,351 | 4 0,572 | 0,765 | 0,510 | 0,294 | 0,214 |
| 40 | 0,340 | 0,560 | 0,750 | 0,508 | 0,306 | 0,216 |
| 60 | 0,334 | 0,560 | 0,741 | 0,489 | 0,380 | 0,218 |
| 80 | 0,327 | 0,548 | 0,725 | 0,482 | 0,398 | 0,238 |
| 95 | 0,316 | 0,508 | 0,737 | 0,466 | 0,408 | 0,253 |
Próbka 1 — preparat kwasu huminowego Mercka; próbka 2 — gleba darniowo-silnie bielicowa Obwodu Moskiewskiego, poziom Ar; próbka 3 — czarnoziem wymyty (górski), poziom.
Wykorzystanie promieniowania ultrafioletowego nie wyklucza możliwości utleniania molekuł humusowych pod wpływem powstającego ozonu. Aby wyeliminować to zastrzeżenie, przeprowadziliśmy serię doświadczeń z naświetlaniem wodnego roztworu kwasu fulwowego i humatu sodu lampą PRK—7, która emituje promieniowanie w obszarach widzialnym i bliskim ultrafioletu. Z rysunku 6 wynika, że przy równych dawkach pochłoniętej energii gęstość optyczna substancji humusowych zmienia się jednakowo pod działaniem promieniowania o dowolnej badanej długości fali.
Doświadczenia potwierdzają, że działanie ozonu, podobnie jak ogrzewanie, może być tylko czynnikiem towarzyszącym, zwłaszcza jeśli wziąć pod uwagę, że ozon powstaje tylko pod działaniem promieniowania o długości fali poniżej 280 nm. Promieniowanie w zakresie 300–330 nm sprzyja niszczeniu ozonu, jego przekształcaniu w tlen cząsteczkowy.
Główną przyczyną zmiany charakterystyk optycznych substancji humusowych podczas naświetlania są **reakcje fotolizy, fotochemicznej destrukcji**. Odbarwieniu roztworów substancji humusowych podczas naświetlania towarzyszy, jak pokazują nasze doświadczenia, zmiana rozkładu mas molekularnych cząstek (rys. 7).
Krzywe sączenia żelowego humatów sodu na sefadeksach mają dwa maksima: A (frakcja wysokocząsteczkowa) i B (frakcja niskocząsteczkowa). Po naświetlaniu wzrasta wydajność frakcji B w porównaniu z A. Porównanie krzywych elucji na żelu wskazuje również na zmniejszenie masy molekularnej kwasu huminowego po naświetlaniu:
- Maksima na krzywych elucji przesuwają się w kierunku niższych mas molekularnych.
- Średnia masowa masa molekularna frakcji niskocząsteczkowej maleje po naświetlaniu z 13800 do 2975.
- Na krzywej eluowania przez sefadeks pojawia się nowa frakcja C, której masa molekularna wynosi 15600.
Pod działaniem światła zmienia się również skład substancji humusowych, na co wskazują widma IR (rys. 8):
- Obserwuje się tendencje do względnego wzmocnienia intensywności pasma 1620–1630 cm⁻¹ w porównaniu z pasmem –COOH (1715 cm⁻¹).
- Nieco wzrasta również absorpcja w obszarze 1000–1100 cm⁻¹ i 3400 cm⁻¹, co można przypisać drganiom deformacyjnym grup hydroksylowych alkoholowych i fenolowych.
Widocznie, działanie światła prowadzi do istotnych zmian w substancjach humusowych:
- zmniejsza się rozmiar ich molekuł;
- wzrasta utlenialność z powodu wzrostu liczby grup karbonylowych (możliwe, że chinonów), grup hydroksylowych alkoholi i fenoli;
- maleje długość łańcuchów sprzężenia — wiązań C=C.
Oprócz wymienionych procesów, intensywne oświetlenie kwasów huminowych powoduje gwałtowny wzrost **centrów paramagnetycznych** (wolnych rodników) w nich. W naszych doświadczeniach stężenie CPM po naświetlaniu roztworów alkalicznych humatów wzrastało z 0,53 do 1,5, przy towarzyszącym spadku gęstości optycznych.
Należy podkreślić, że destrukcja fotochemiczna kwasów huminowych zachodzi nie tylko pod wpływem stosunkowo mocnych źródeł promieniowania. Jeśli naświetlanie lampami obniża gęstość optyczną humatów o 50–70% w ciągu 15–20 godzin, to przy oświetleniu dziennym ten sam efekt osiąga się w ciągu 4–8 miesięcy. Dane eksperymentalne konsekwentnie wskazują na fotochemiczną destrukcję kwasów huminowych, przebiegającą jako procesy utleniania z udziałem wolnych rodników.
Ten sam proces musi nieuchronnie mieć miejsce podczas ekstrakcji substancji humusowych roztworami alkalicznymi z gleb i dalszego przygotowania preparatów huminowych.
Zatem można przypuszczać, że w trakcie przygotowania preparatów huminowych następuje **aktywacja substancji humusowych**, która obejmuje:
- zmianę konformacji ich molekuł;
- uwolnienie grup funkcyjnych;
- częściowy rozpad frakcji najbardziej wysokocząsteczkowych na fragmenty składowe o mniejszej MM;
- częściowe utlenianie z nagromadzeniem grup karbonylowych (możliwe, że chinonowych);
- zwiększenie stężenia centrów paramagnetycznych.
Molekuły aktywowane w ten sposób mają bardziej energiczny wpływ na rozwój roślin i warunki ich odżywiania. Te same czynniki: oświetlenie, temperatura, okresowość i stopień suszenia, nieuchronnie muszą prowadzić do różnic w wielu właściwościach kwasów huminowych typów gleb strefowych.