Frakcjonowanie substancji humusowych leonardytu

Substancje humusowe nie są chemicznie jednorodnymi związkami, lecz stanowią mieszaninę substancji różnego pochodzenia, różniących się masą cząsteczkową i budową chemiczną, a jednocześnie mniej lub bardziej zbliżonych pod względem właściwości. Dlatego też, stosując różnorodne metody, można je rozdzielić na szereg frakcji różniących się właściwościami fizykochemicznymi i biologicznymi.

Frakcjonowanie substancji humusowych przeprowadza się: za pomocą różnych rozpuszczalników, poprzez frakcjonowane strącanie z roztworów kationami wielowartościowymi przy różnych wartościach pH, poprzez ekstrakcję z surowca roztworami alkalicznymi o wzrastającym stężeniu, z zastosowaniem elektroforezy i chromatografii, rozdziałem na sefadeksach itp. Większość badaczy przeprowadza rozdział substancji humusowych w celu zbadania ich budowy, pochodzenia i właściwości fizykochemicznych. Naszym zadaniem jest zbadanie aktywności fizjologicznej.

Ponieważ w większości przypadków pierwszym etapem rozdziału substancji humusowych jest ich ekstrakcja z surowca (torfu, węgla, leonardytu itp.) za pomocą jakiegoś rozpuszczalnika, postanowiliśmy na początku zbadać aktywność fizjologiczną frakcji leonardytu ze złoża Zamgłaj w obwodzie czernihowskim, uzyskanych przy użyciu różnych rozpuszczalników.

Uzyskaliśmy frakcje: benzenową, alkoholową, wodną i alkaliczną. Ta ostatnia została rozdzielona na kwasy fulwowe, kwasy hymatomelanowe i kwasy huminowe. Ich charakterystykę przedstawiono w tabeli 1.

Aktywność fizjologiczną frakcji w stężeniu 0,005% sprawdzano za pomocą trzech testów: badano ich wpływ na wzrost siewek jęczmienia, na przyrost jęczmienia i namnażanie komórek drożdży. Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabelach 2, 3 i 4.

Analizując wyniki doświadczeń, można zauważyć co następuje:

• Wszystkie frakcje substancji organicznej leonardytu wywarły zauważalny wpływ na wzrost korzeni jęczmienia. Nieco silniejszy był on w przypadku frakcji kwasów huminowych, a słabszy w przypadku kwasów hymatomelanowych.
• Przejaw stymulującego działania frakcji na wzrost masy nadziemnej był w przybliżeniu równy i słabszy, co można wytłumaczyć krótkotrwałością doświadczeń, które trwały 10—12 dni, licząc od momentu posadzenia wykiełkowanych nasion na roztworach.
• Aktywność auksynowa frakcji, w porównaniu z heteroauksyną, jest stosunkowo niewielka: jest nieco wyższa u kwasów hymatomelanowych i niższa u frakcji benzenowej i alkoholowej.
• Wszystkie frakcje wywarły dość znaczący wpływ na namnażanie komórek drożdży, ale szczególnie duży jest on w przypadku frakcji wodnej i kwasów fulwowych.

Największą, pod względem zawartości w leonardycie i ilości przy ekstrakcji, jest frakcja kwasów huminowych i fulwowych. A ponieważ to one, według wstępnych danych, wywierają najsilniejsze działanie regulujące na wzrost i rozwój roślin wyższych, to właśnie od tej frakcji postanowiono rozpocząć pełniejsze badanie substancji humusowych leonardytu.

Do frakcjonowania kwasów huminowych zastosowaliśmy dwie metody. Według pierwszej metody naważkę leonardytu zalewano pięciokrotną objętością 0,1 N roztworu KOH i macerowano przez dobę przy ciągłym mieszaniu. Po odstaniu roztwór zlewano do butli, a osad ponownie zalewano takim samym roztworem ługu i operację ekstrakcji powtarzano. Po 4—5-krotnej ekstrakcji cały roztwór połączono i poprzez zmianę wartości pH oraz wirowanie rozdzielono na osiem węższych frakcji. Warunki ich wydzielania i charakterystykę przedstawiono w tabeli 5. Należy zauważyć, że przy rozpuszczaniu pierwszych dwóch frakcji roztwór staje się lekko mętny.

Określenie aktywności fizjologicznej roztworów frakcji o stężeniu 0,005%, tak samo jak w poprzednich przypadkach, przeprowadzono za pomocą trzech testów (tabele 6, 7 i 8).

Porównując działanie fizjologiczne frakcji kwasów huminowych (tab. 6) z działaniem frakcji substancji organicznej leonardytu, przedstawionym w tab. 2, na wzrost siewek jęczmienia, można zauważyć, że na wzrost masy nadziemnej wszystkie frakcje wpływają w przybliżeniu jednakowo. Jeśli zaś chodzi o system korzeniowy, to dwie frakcje kwasów huminowych (3 i 4), w dwóch doświadczeniach z trzech, wywarły silniejszy wpływ na jego wzrost niż wszystkie pozostałe, których działanie było w przybliżeniu równe, ale nieco niższe niż działanie niefrakcjonowanego humianu potasu (standard). Aktywność auksynowa frakcji kwasów huminowych, w porównaniu z heteroauksyną, jest nieznaczna i równa omówionym wyżej frakcjom.

Dodanie do pożywki Riedera roztworów frakcji kwasów huminowych gwałtownie nasiliło namnażanie drożdży. Jest to szczególnie widoczne w przypadku frakcji nr 8, która swoimi właściwościami zbliża się do kwasów fulwowych. Jednak największą aktywność wykazał niefrakcjonowany humian potasu (standard). Tłumaczy się to ewidentnie tym, że w jego skład wchodzą zarówno substancje rozpuszczalne w wodzie, jak i kwasy fulwowe, które w poprzednim doświadczeniu (tab. 4) wykazały najlepsze wyniki.

Jednak ustalenie zależności wielkości aktywności fizjologicznej frakcji od zawartości lub ilości tych czy innych grup funkcyjnych nie wydaje się możliwe. Komplikuje to nie tylko fakt, że aktywność frakcji zmienia się w stosunku do różnych testów, ale także to, że nie pozostaje ona stabilna przy powtarzaniu doświadczeń z tymi samymi testami: w jednych doświadczeniach aktywność jakiejś frakcji może być wyższa niż aktywność innych, w innych zaś — nieco niższa. Z dużym prawdopodobieństwem aktywność fizjologiczna frakcji substancji organicznej leonardytu zależy nie tyle od obecności i ilości grup funkcyjnych, co od struktury molekularnej związków chemicznych wchodzących w ich skład.

Jako drugą metodę wydzielania kwasów huminowych zastosowaliśmy sposób sukcesywnej ekstrakcji z leonardytu 0,02 N roztworem KOH. Leonardyt zalewano pięciokrotną objętością roztworu alkalicznego i macerowano przez dobę przy ciągłym mieszaniu. Po odstaniu roztwór wirowano przez pół godziny przy 3000 obrotów na minutę i zlewano do szklanej butli, w której wyekstrahowaną frakcję kwasów huminowych wytrącano kwasem solnym. Uzyskany osad oddzielano przez wirowanie i przemywano wodą destylowaną do odczynu obojętnego wód popłucznych, a następnie suszono w temperaturze 40°C.

Pozostały leonardyt ponownie zalewano pięciokrotną objętością roztworu alkalicznego o wskazanym wyżej stężeniu i całą operację ekstrakcji powtarzano. W ten sposób wydzieliliśmy 31 frakcji kwasów huminowych. Ich charakterystykę podano w tabeli 9.

Z tabeli widać, że właściwości fizykochemiczne frakcji nie są jednakowe. Pierwsze frakcje mają znacznie więcej aktywnych grup kwaśnych i nieco większą gęstość optyczną niż ostatnie.

Aktywność fizjologiczną frakcji sprawdzano w doświadczeniu z pszenicą ozimą. Nasiona pszenicy kiełkowano przez dobę, a następnie przesadzano na wodę destylowaną (kontrola) i roztwory frakcji kwasów huminowych o stężeniu 0,003%. W celu otrzymania roztworów frakcji kwasów huminowych o stężeniu 0,003%, naważkę suchej substancji frakcji w ilości 30 mg (w przeliczeniu na absolutnie suchą substancję bezpopiołową) rozcierano w moździerzu z dwoma mililitrami 0,1 N KOH, a następnie dopełniano wodą destylowaną do jednego litra.

Na roztworach siewki pszenicy hodowano przez 10 dni. Następnie doświadczenie przerywano i określano długość korzeni i liści roślin, a także ich świeżą i suchą masę.

Na podstawie wyników doświadczenia (tab. 10) można zauważyć, że pod wpływem roztworów frakcji kwasów huminowych zwiększała się długość korzeni i liści w porównaniu z kontrolą, a także świeża i sucha masa siewek pszenicy. Świadczy to nie tylko o nasileniu podziałów i wzrostu komórek roślinnych, ale także procesów syntezy w nich zachodzących. Wpływ poszczególnych frakcji kwasów huminowych na wzrost korzeni, liści i gromadzenie suchej masy przez siewki pszenicy nie jest jednakowy. Przyrost długości korzeni waha się od 20 do 70%, liści — od 16 do 32, gromadzenie suchej masy — od 7 do 32%. Ale różnice w sile działania między frakcjami, w przeciwieństwie do frakcji wydzielonych drogą zmiany wartości pH i wirowania (tab. 6), są niewielkie i przy powtarzaniu doświadczeń, tak samo jak w opisanych wyżej przypadkach, nie pozostają stabilne zarówno pod względem wartości bezwzględnej, jak i w stosunku do siebie, chociaż właściwość stymulująca frakcji jest zachowana we wszystkich przypadkach.

Wiadomo, że słabe roztwory kwasów huminowych w każdych warunkach wpływają na przebieg procesów biochemicznych w roślinach i są swoistymi regulatorami ich wzrostu i rozwoju. Szczególnie ostro przejawia się to w obecności substancji odżywczych, ale w warunkach niesprzyjających ich przyswajaniu.

Przykładem tego może być doświadczenie przeprowadzone przez nas z pomidorami odmiany „Kijowskie”. Czynnikiem niesprzyjającym w tym doświadczeniu była woda destylowana o pH równym 5,8. Pożywka Kossowicza została przygotowana na tej samej wodzie i miała taką samą wartość pH. Nasiona pomidorów kiełkowano na wodzie. Po czterech dniach wykiełkowane nasiona wysadzono na wodę destylowaną, mieszankę Kossowicza i roztwory frakcji kwasów huminowych, a po kolejnych 10 dniach przeprowadzono pomiary długości korzeni i łodyg oraz określono świeżą i suchą masę siewek. Wyniki doświadczeń przedstawiono w tabeli 11.

Podczas uprawy siewek pomidorów na wodzie destylowanej o pH 5,8 ich system korzeniowy i część nadziemna były silnie zahamowane. Dodanie różnych frakcji kwasów huminowych nieco zwiększyło przyrost korzeni i łodyg, ale sucha masa siewek zmieniła się bardzo nieznacznie z powodu braku w roztworach niezbędnych składników odżywczych do syntezy substancji białkowych komórek.

Zupełnie inny obraz widzimy podczas uprawy siewek pomidorów na pożywce Kossowicza z dodatkiem do niej roztworów frakcji kwasów huminowych, pomimo tego, że wartość pH w roztworach nie zmieniła się i pozostała równa pH wody destylowanej. Jeśli na mieszance Kossowicza przyrost korzeni, łodyg i suchej masy nieznacznie wzrósł w porównaniu z wodą destylowaną, to po dodaniu do mieszanki kwasów huminowych nie tylko gwałtownie nasilił się wzrost korzeni i łodyg, ale także znacznie zwiększyło się gromadzenie suchej masy przez siewki.

W ten sposób można wyciągnąć wniosek, że frakcje substancji organicznej leonardytu posiadają właściwości stymulujące. Charakter i siła działania frakcji zależy zarówno od struktury molekularnej substancji wchodzących w ich skład, jak i od cech organizmu, na który działają, oraz od warunków środowiska zewnętrznego. Siła ich działania wzrasta w warunkach niekorzystnych, a maleje w sprzyjających. Przy zastosowaniu odpowiednich metod rozdziału wydaje się możliwe uzyskanie węższych frakcji lub nawet indywiduów chemicznych posiadających specyficzną aktywność fizjologiczną.