O naturze aktywności fizjologicznej humianu
Wpływ fizjologicznie aktywnych form kwasów humusowych i związków podobnych, takich jak polifenole, na metabolizm oksydacyjny można uznać za solidnie ustalony fakt. Różni badacze przedstawiają różne wyjaśnienia tego zjawiska. My od wielu lat wyrażamy pogląd, że kluczowe znaczenie ma tutaj fakt, iż grupy chinonowe tych związków, będąc nośnikami wodoru od utlenianego obiektu do tlenu, wzmacniają najważniejszy system transportu elektronów, a tym samym łagodzą niedobór tlenu w komórkach, który, jak pokazują obserwacje, występuje częściej, niż się powszechnie uważa. Wszystko to prowadzi do wzmocnienia potencjału energetycznego roślin, co potwierdzają eksperymentalnie pomiary potencjału bioelektrycznego — BEP, wskaźniki stanu termodynamicznego roślin i pozytywnie wpływa na metabolizm organizmu.
Jeden z najbardziej odważnych biochemików, Sąd-Györgyi, wyraził ideę, że wszystkie procesy biochemiczne to stopniowe obniżanie poziomu elektronu, który został podniesiony na wyższy poziom w wyniku absorpcji kwantu światła podczas fotosyntezy. Bernard i Alberte Pullman z kolei stwierdzili: „Dynamika życia jest zgodna z dynamiką chmury elektronowej w sprzężonych cząsteczkach...”. Główną cechą tych cząsteczek uznali obecność w nich zdelokalizowanych elektronów, które nadają cząsteczce dodatkową stabilność, odporność na promieniowanie, możliwość przenoszenia wzbudzenia elektronowego na duże odległości, możliwość transferu elektronu i energii itp.
Zdelokalizowane lub niesparowane elektrony zyskały takie znaczenie, ponieważ są łatwiej wzbudzane niż sparowane. Wzbudzenie elektronu, czyli przeniesienie go z niższego poziomu energetycznego na wyższy, jest określane przez absorpcję kwantu światła widzialnego lub ultrafioletowego. Proces odwrotny towarzyszy emisji kwantu i świeceniu światła, czyli luminescencji. Taki transfer elektronu odpowiada wewnątrzcząsteczkowemu poziomowi procesów oksydacyjno-redukcyjnych. Międzycząsteczkowy transfer zdelokalizowanego elektronu jest już związany z procesami oksydacyjno-redukcyjnymi na poziomie międzycząsteczkowym, czyli z oddychaniem. Jest oczywiste, że oba te procesy są ze sobą powiązane, a ponieważ wpływ kwasów humusowych i fulwowych na procesy oddychania jest solidnie ustalonym faktem, można przypuszczać, że wpływają one również na wzbudzenie elektronu.
Istnieje podstawy, by sądzić, że fizjologicznie aktywne formy kwasów humusowych i fulwowych, po wniknięciu do roślin, wpływają na dostrojenie poziomów energetycznych zdelokalizowanych elektronów sprzężonych cząsteczek i tym samym oddziałują na najważniejsze procesy życiowe. Jeśli to założenie jest prawidłowe, to po pierwsze, fizjologicznie aktywne humiany powinny sprzyjać lepszej absorpcji energii słonecznej, przy czym ich skuteczność w różnych częściach spektrum powinna być różna; po drugie, powinny wpływać na właściwości paramagnetyczne tkanek roślinnych; po trzecie, pod wpływem humianów powinny wzmacniać się ich właściwości luminescencyjne. Nie stawiając sobie za cel ilościowego określenia tych procesów i wyjaśnienia ich mechanizmu, podjęliśmy to badanie jedynie w celu eksperymentalnego sprawdzenia przedstawionego założenia.
Metodyka badań
W celu rozwiązania postawionych zadań przeprowadzono krótkoterminowe doświadczenia mikrowzrostowe w warunkach różnego spektrum. Metodyka doświadczeń była następująca: nasiona kukurydzy i fasoli mung umieszczano w naczyniach do kiełkowania, moczone roztworami zgodnie ze schematem doświadczenia i umieszczano w ciemnym termostacie. Następnie pięcio- i siedmiodniowe etiolowane kiełki przesadzano do szklanek o pojemności 500 ml po 5 roślin do każdej, na podłoże zgodnie ze schematem doświadczenia i umieszczano pod instalacją świetlną w sekcjach z różnymi kolorowymi ekranami. Oświetlenie zapewniały lampy dzienne o natężeniu 3500 lx/m². Ekrany przygotowano poprzez nałożenie kolorowych folii, otrzymanych metodą Grodzińskiego, na szkło o wymiarach 36 × 48 cm. Ich charakterystykę spektralną określano na SF-4A.
W schemacie doświadczenia uwzględniono humian potasu, który testowano w stężeniach 3.1⋅10⁻⁵ mol/l i ATP — 1.4⋅10⁻⁵ mol/l (ta ostatnia jako dodatkowa kontrola jako związek bogaty w energię). Podłożem była albo uboga mieszanina Prianishnikova, w której fosfor podawano w postaci buforowej soli Sörensena, albo woda destylowana. Doświadczenie założono w trzech powtórzeniach. Trwało ono 7 dni, po czym rośliny mierzono, ważono i analizowano pod kątem następujących wskaźników: chlorofil metodą Getriego, substancje nukleinowe metodą Netubskiej i Kuramszyna. Założono 27 takich doświadczeń.
W celu wyjaśnienia pytania — czy rozpuszczalne humiany wpływają na właściwości paramagnetyczne tkanek roślinnych — zastosowano metodę elektronowego rezonansu paramagnetycznego (ERP). Jak wiadomo, istota metody ERP polega na rezonansowej absorpcji energii elektromagnetycznej o wysokiej częstotliwości przez obiekt przy ściśle określonych stosunkach natężenia pola magnetycznego i częstotliwości. Metoda ERP opiera się na znanym efekcie Zeemana, który polega na tym, że po wprowadzeniu cząstki paramagnetycznej, charakteryzującej się obecnością niesparowanego elektronu i kwantową liczbą spinową S, stałe pole magnetyczne rozszczepia jej podstawowy poziom energetyczny na 2S+1 podpoziomów, oddzielonych od siebie odstępami energii:
ΔE=hν=gbH, gdzie H — natężenie pola magnetycznego, ν — częstotliwość.
Po przyłożeniu do próbki paramagnetycznej, umieszczonej w stałym polu magnetycznym „H”, wysokoczęstotliwościowego (HF lub mikrofalowego) pola magnetycznego z prostopadłą do H orientacją wektora magnetycznego, przy częstotliwości:
ν=hΔE=hgbH
z równym prawdopodobieństwem indukowane są przejścia między dwoma sąsiednimi poziomami, gdzie:
- g — czynnik rozszczepienia spektroskopowego;
- b — magneton Bohra;
- h — stała Plancka.
W tym przypadku następuje redystrybucja obsadzenia poziomów energetycznych w kierunku ich wyrównania, część energii pola mikrofalowego jest absorbowana w próbce i wydatkowana na jej ogrzewanie. Zadaniem doświadczenia przy obserwacji zjawiska ERP jest dokładna rejestracja energii wysokoczęstotliwościowej absorbowanej przez próbkę. Wielu naukowców badało zjawisko elektronowego rezonansu paramagnetycznego w całym szeregu biologicznie aktywnych związków i w żywych tkankach, wykazując jego skuteczność dla tego celu.
Jako obiekt badań pobierano liście i korzenie pięcio-, sześciodniowych kiełków fasoli mung, hodowanych w określonych warunkach, i poddawano je liofilizacji po zamrożeniu do temperatury −70°. Suszono je przez 24 godziny do ciśnienia resztkowego 10⁻³ mm Hg. Do badań ERP próbki wysuszonych liści i korzeni o masie 3-5 mg umieszczano w cienkościennych rurkach kwarcowych o średnicy 4-5 cm, które wyżarzano w płomieniu acetylenowo-tlenowym. Widma ERP rejestrowano w postaci pierwszej pochodnej krzywej rezonansowej absorpcji. Zawartość wolnych rodników w próbce określano przez porównanie wzorca i pól pod krzywymi całkowymi rezonansowej absorpcji badanego związku, które budowano na podstawie krzywych różniczkowych I′=f(H) przy ν=const. Pola obliczano metodą podwójnej integracji graficznej. Jako wzorzec do pomiaru szerokości linii badanych widm służył γ-napromieniowany alanina, a przy określaniu pól — γ-napromieniowana sacharoza. Do określenia czynnika g stosowano próżniowe rurki ze wzorcem Mn++ w MgO, dla których dokładnie znane są wartości czynnika g. Do przybliżonych obliczeń pól pod krzywymi całkowymi stosowano wzory Simpsona.
Aby stwierdzić wpływ kwasu humusowego na luminescencję roślin hodowanych w różnych warunkach spektrum, postępowano następująco: próbkę tkanki liści rozcierano z wodą w stosunku 2:100 i pozostawiano na pewien czas. Następnie do określonej objętości przesączonego ekstraktu dodawano po 1 ml fluoresceiny 10⁻³ mol/l, naświetlano światłem ultrafioletowym (szkło Wooda) przez 5 min, po czym określano względną intensywność fluorescencji.
Wyniki badań
Przede wszystkim przeanalizujmy najbardziej charakterystyczne dane pokazujące wpływ kwasów humusowych i ATP na akumulację suchej masy w różnych częściach spektrum. Wykazują one, że akumulacja suchej masy w kiełkach kukurydzy była maksymalna w czerwono-pomarańczowej i niebiesko-fioletowej części spektrum, minimalna — w zielonej części. Analogiczna była reakcja roślin na fizjologicznie aktywne formy kwasów humusowych i ATP.
Łatwo zauważyć, że reakcja kiełków kukurydzy na fizjologicznie aktywne substancje pod względem tworzenia suchej masy powtarza krzywą absorpcji światła przez chlorofil, co daje podstawy do przypuszczenia, że substancje fizjologicznie aktywne wpływają na reakcje fotochemiczne fotosyntezy i sprzyjają lepszej absorpcji energii słonecznej. To doświadczenie powtarzano wielokrotnie i dawało zbliżone wyniki z pewnym przesunięciem maksimum akumulacji masy w obrębie fioletowej części spektrum. Fasola mung okazała się pod tym względem mniej reaktywna.
Wpływ substancji fizjologicznie aktywnych przejawia się nie tylko w tworzeniu suchej masy, ale także w morfogenezie roślin, przy czym różni się od wpływu na masę. Okazało się, że korzenie stosunkowo lepiej reagują na humiany w niebiesko-fioletowej części spektrum, a liście — w czerwono-pomarańczowej.
Obserwacje dotyczące wpływu badanych czynników na zawartość chlorofilu wykazały, że maksimum reakcji u kukurydzy pod tym względem przesuwa się od krótkofalowej części spektrum do długofalowej. W niektórych przypadkach szczyt występuje w żółto-zielonej części spektrum. Reakcja roślin na zmianę składu spektralnego pod względem ilości chlorofilu jest dość stała i bardziej związana z intensywnością światła. Obserwacje dotyczące zawartości kwasów nukleinowych pokazują, że działanie substancji fizjologicznie aktywnych przy różnej jakości światła niewątpliwie wpływa na ten aparat komórki roślinnej. Jednak rozbieżność danych w różnych doświadczeniach nie pozwala jeszcze ustalić kierunku tego procesu.
Dane pomiarów ERP i odpowiednie obliczenia przedstawiono w tabelach 1 i 2. Dane te pokazują, że ERP tkanek roślinnych fasoli mung, poddanych liofilizacji, są reprezentowane przez pojedyncze linie z czynnikiem g, zbliżonym do czynnika g wolnego elektronu (dla liści gśr. wynosi 2.00388±0.0005 i ΔHśr.−18.1±0.2 e; dla korzeni gśr.−2.00349±0.0005 i ΔHśr.−13.5±0.2 e).
| Wskaźniki | Nasiona kiełkowane na | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Wodzie | Humianie potasu | ATP | 2,4-DNF | |||
| Kiełki przesadzone na | Wodę | Humian potasu | ATP | 2,4-DNF | ||
| ΔН e | 15,9 | 18,2 | 16,4 | 19,0 | ||
| g-czynnik | 2,00441 | 2,00279 | 2,00489 | 2,00438 | ||
| S-całkowe (mm²) | 150 | 220 | 120 | 175 | ||
| Uwaga. Dla wzorca γ-sacharozy, zawierającej 10¹⁷ spinów/g, S-całkowe wynosi 455 mm². | ||||||
| Wskaźniki | Nasiona kiełkowane na | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| wodzie | humianie potasu | ATP | 2,4-DNF | |||
| Kiełki przesadzone na | wodę | humian potasu | ATP | 2,4-DNF | ||
| ΔН e | 11,2 | 14,5 | 16,3 | 9,6 | ||
| g-czynnik | 2,00461 | 2,00440 | 2,00473 | 2,00380 | ||
| S-całkowe (mm²) | 20 | 40 | 60 | 12 | ||
Z porównania krzywych różniczkowych wynika, że humiany potasu i ATP zwiększają amplitudę sygnału ERP, a 2,4-dinitrofenol go tłumi. Bardzo ważne jest, że dodatkowe przesadzenie roślin z tego inhibitora na substancje fizjologicznie aktywne w pewnym stopniu przywraca sygnał ERP, co koreluje z reakcją fizjologiczną roślin na te substancje. Analogiczny był ich wpływ na krzywą całkową, co pozwala mówić o zwiększeniu liczby wolnych rodników pod wpływem substancji fizjologicznie aktywnych. Warto również zauważyć, że liczba wolnych rodników w liściach była znacznie większa niż w korzeniach.
Działanie fizjologiczne kwasów humusowych należy powiązać z obecnością w nich wolnych rodników. Obecność wolnych rodników w kwasach humusowych gleby metodą ERP została później wykazana w pracach w naszym laboratorium.
Stopień luminescencji ekstraktów z roślin hodowanych w różnych częściach spektrum i otrzymujących lub nieotrzymujących substancje fizjologicznie aktywne, waha się. Zarysowała się tendencja do zwiększenia efektu w tym zakresie od humianów potasu w czerwono-pomarańczowej części spektrum. Wpływ ATP pozostał niejasny.
Wnioski
- Uzyskane wyniki przede wszystkim pokazują, że reakcja roślin na fizjologicznie aktywne formy humianów w różnych częściach spektrum jest niejednakowa: jest większa w czerwono-pomarańczowej i niebiesko-fioletowej części, czyli w tej części spektrum, która jest lepiej absorbowana przez chlorofil.
- Określenie sygnału ERP w tkankach fasoli mung wykazało, że pod wpływem substancji fizjologicznie aktywnych zwiększa się w nich liczba centrów paramagnetycznych.
- Przedstawione powyżej fakty, a także zmiana intensywności luminescencji ekstraktów z roślin w obecności fluoresceiny pozwalają przypuszczać, że fizjologicznie aktywne humiany sprzyjają absorpcji kwantów światła i wpływają na dostrojenie poziomu energetycznego zdelokalizowanych elektronów sprzężonych cząsteczek wchodzących w skład tkanek roślinnych.