Właściwości kwasów humusowych różnych gleb Ukrainy i ich aktywność fizjologiczna
Substancje humusowe, pomimo wspólnych cech strukturalnych, nie są chemicznie indywidualnymi związkami. Reprezentując grupę polimerów o budowie aromatycznej, substancje te są niejednorodne pod względem natury i właściwości. Wspólną cechą wszystkich kwasów humusowych wyizolowanych z różnych gleb jest udział w ich powstawaniu polifenoli. Nasi naukowcy zaproponowali wzór kwasów humusowych czarnoziemu, torfu i leonardytu, których wspólną cechą jest obecność w ich cząsteczce grup polifenolowych i chinoidowych.
Różnorodność substancji humusowych przejawia się w różnym stopniu kondensacji pierścieni aromatycznych w ich cząsteczkach, w stosunku struktur aromatycznych i alifatycznych itp. Różnice w naturze i właściwościach kwasów humusowych różnego pochodzenia znajdują odzwierciedlenie w nierównej aktywności fizjologicznej tych ostatnich.
Badacze z wielu krajów wskazywali na wielostronny udział substancji humusowych w procesach fizjologicznych i biochemicznych zachodzących w roślinach. Ustalono, że substancje humusowe różnego pochodzenia w małych stężeniach wywierają głęboki i wielostronny wpływ na rośliny. Jednak substancje humusowe różnych gleb nie są identyczne. Wynika z tego, że ich działanie na rośliny nie może być całkowicie takie samo. Logiczne jest założenie, że charakter i stopień wpływu kwasów humusowych z różnych gleb na organizm roślinny są wprost proporcjonalne do składu i właściwości tych kwasów. Badaniu tego zagadnienia w zakresie głównych typów gleb Ukrainy poświęcono niniejsze badanie.
Badanie natury i właściwości kwasów humusowych
Metody frakcjonowania
Stosując różne metody frakcjonowania (frakcjonowane strącanie kwasami i roztworami buforowymi, ultrawirowanie, różne rodzaje chromatografii, elektroforeza i inne), substancje humusowe można podzielić na kilka frakcji. Za pomocą elektroforezy na paskach papieru kwas humusowy podzielono na dwie frakcje, które kolorystycznie odpowiadały szarym i brązowym kwasom humusowym. Wszystkie kwasy humusowe, zdaniem badaczy, są mieszaniną tych dwóch frakcji z przewagą jednej lub drugiej.
Dzięki metodom chromatografii na kolumnach skrobiowych i papierze oraz elektroforezie na papierze udało się podzielić kwasy humusowe czarnoziemu i gleby darniowo-bielicowej na trzy frakcje, z których jedna jest widoczna tylko w świetle ultrafioletowym. Ponieważ podział kwasów humusowych za pomocą elektroforezy na paskach papieru nie pozwala na uzyskanie wystarczającej ilości poszczególnych frakcji, naukowcy przeszli do metody elektroforezy ciągłej, za pomocą której udało się podzielić kwas humusowy na 10–15 frakcji, reprezentujących przejście od szarych do brązowych kwasów humusowych.
Podczas frakcjonowania kwasów humusowych różnych gleb za pomocą chromatografii kołowej na papierze ich strefy różniły się między sobą. U kwasu humusowego z czarnoziemu strefy były bardziej zwarte, podczas gdy u kwasu humusowego gleby darniowo-bielicowej miały rozmyty wygląd.
Frakcjonowanie kwasów humusowych metodą elektroforezy wykazało również, że kwasy humusowe czarnoziemu składają się z frakcji mało ruchliwych w polu elektrycznym, z których większość pozostaje na starcie, a tylko niewielka ilość przemieszcza się w kierunku anody. Kwasy humusowe czerwonoziemu i gleby darniowo-bielicowej miały zwiększoną ruchliwość i zdolność fluorescencji.
W naszej pracy izolację preparatów kwasów humusowych z różnych gleb przeprowadzono z gleby wstępnie odwapnionej. Do badania natury i właściwości kwasów humusowych zastosowano metody chromatografii kołowej i elektroforezy na papierze.
Frakcjonowanie kwasów humusowych za pomocą chromatografii kołowej przeprowadzono metodą Kononowej i Belczikowej z tą różnicą, że użyto szybko filtrującego papieru, co pozwoliło skrócić ekspozycję do dwóch godzin. W świetle dziennym na chromatogramach wszystkich kwasów humusowych obserwowano dwie strefy: pierwszą — w centrum chromatogramu, w miejscu naniesienia preparatu, i drugą — w pewnej odległości od pierwszej w postaci wąskich, jasnobrązowych pierścieni. Kwasy humusowe czarnoziemu dawały wąskie i bardziej zwarte pierścienie, gleby darniowo-bielicowej — rozmyte, a z pozostałych gleb pierścienie zajmowały pozycję pośrednią. W świetle ultrafioletowym chromatogramy wyglądały inaczej: obserwowano trzy strefy. Bezpośrednio wokół ciemno zabarwionej plamy widoczny był jeszcze jeden pierścień, posiadający właściwości fluorescencji, który u kwasu humusowego czarnoziemu fluoryzował światłem pomarańczowo-żółtym, gleby darniowo-bielicowej — jasnożółtym z niebieskawym odcieniem, a kwasy humusowe z pozostałych gleb dawały fluorescencyjne pierścienie o pośrednich odcieniach. Następny pierścień, który w świetle dziennym miał jasnobrązowy odcień, w świetle ultrafioletowym fluoryzował w tej samej kolejności kolorów.
Po godzinnej rozgonce na paskach papieru wyodrębniono dwie strefy: pierwszą, pozostającą na starcie, zabarwioną na szarawy kolor; drugą, znajdującą się w pewnej odległości od pierwszej, zabarwioną na brązowawy kolor. W świetle ultrafioletowym wykryto trzecią strefę o zdolności fluorescencji, przy czym u kwasów humusowych czarnoziemu fluoryzowała ona światłem pomarańczowo-żółtym, gleby darniowo-bielicowej — żółtym, a pozostałych — odcieniami pośrednimi.
Różnice w charakterze rozmieszczenia substancji w strefach ilustrują krzywe zapisane za pomocą densytometru. U kwasów humusowych czarnoziemu i gleby ciemnokasztanowej większość substancji pozostaje na starcie, a tylko niewielka część przemieszcza się w kierunku anody. Najintensywniejsze przemieszczanie obserwuje się na foregramie kwasu humusowego gleby darniowo-bielicowej, gdzie większość substancji przemieszcza się w kierunku anody. Kwas humusowy i fulwowy gleby szarej zubiałej zajmują pozycję pośrednią.
Zatem frakcjonowanie kwasów humusowych za pomocą chromatografii i elektroforezy potwierdza tezę o niejednorodności kwasów humusowych, przy czym stosunek frakcji ruchliwych i nieruchliwych w kwasach humusowych różnych typów gleb jest nierówny: kwas humusowy czarnoziemu zawiera mniej frakcji ruchliwych, gleby darniowo-bielicowej — więcej. Zawartość tych lub innych frakcji w składzie substancji humusowych determinuje ich naturę — stopień kondensacji pierścienia aromatycznego, stosunek struktur aromatycznych, obecność i rozmieszczenie grup funkcyjnych itp.
Wielkość gęstości optycznej i próg koagulacji charakteryzują stopień dyspersji substancji humusowych i są pośrednimi wskaźnikami stopnia ich złożoności lub kondensacji cząstek. Gęstość optyczną określano metodą Kononowej na fotometrze. Próg koagulacji ustalano na podstawie najmniejszej ilości elektrolitu (CaCl₂) potrzebnej do całkowitej koagulacji kwasu humusowego w określonym czasie. Stężenie roboczego roztworu kwasu humusowego wynosiło 0,136 g/l.
| Obiekty badań | Gęstość optyczna (λ=440 nm) | Ilość CaCl₂ na 1 g humatu, mg-ekw | ||
|---|---|---|---|---|
| Początek koagulacji | Pojawienie się osadu po 30 minutach | Pełna koagulacja (po 2 i 4 godzinach) | ||
| Kwasy humusowe z: | ||||
| Gleby darniowo-bielicowej | 1,32 | 5 | 18 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (20) |
| Gleby szarej zubiałej | 1,92 | 4 | 14 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (18) |
| Czarnoziemu zubiałego | 2,32 | 3 | 12 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (16) |
| Czarnoziemu zwyczajnego | 2,52 | 1 | 10 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (18) |
| Gleby ciemnokasztanowej | 2,08 | 2 | 13 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (20) |
| Czarnoziemu południowego węglanowego | 1,68 | 4 | 15 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (18) |
| Gleby brązowej | 1,08 | 4 | 15 | Roztwór nad osadem jasnobrązowy (18) |
Dane z tabeli 1 pokazują, że stopień kondensacji sieci aromatycznych atomów węgla w kwasach humusowych i fulwowych od gleb darniowo-bielicowych do czarnoziemów wzrasta przy jednoczesnym zmniejszeniu się w ich cząsteczkach bocznych łańcuchów alifatycznych. Odwrotny stosunek tych struktur obserwuje się u kwasów humusowych przy przejściu od czarnoziemów do gleb kasztanowych i dalej do gleb brązowych. Tezę tę potwierdzają wyniki uzyskane przy określaniu progu koagulacji kwasów humusowych i fulwowych. Dane z tabeli wskazują na wysoką dyspersję kwasów humusowych gleb darniowo-bielicowych i brązowych, co świadczy o dużej zawartości w ich cząsteczkach bocznych rodników niosących grupy hydrofilowe.
Wszystko to świadczy o tym, że przy przejściu od gleb darniowo-bielicowych do czarnoziemów natura kwasów humusowych ulega komplikacji: wyraźniej przejawia się w nich skondensowany pierścień aromatyczny przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości bocznych rodników; zjawisko odwrotne obserwuje się przy przejściu od czarnoziemów zwyczajnych do południowych węglanowych i gleb brązowych.
Obecność grup funkcyjnych (karboksylowych i fenolowych hydroksyli) determinuje właściwości kwasowe i pojemność wymienną kwasów humusowych i fulwowych. Całkowitą zawartość grup funkcyjnych w kwasach humusowych określano metodą Dragunowej, a zawartość grup karboksylowych — metodą Kucharenki, tj. przez moczenie próbek kwasów humusowych w 0,5 n. roztworze octanu wapnia o pH 6,8–7. Wyniki analiz przedstawiono w tabeli 2.
| Obiekty badań | Całkowita ilość grup funkcyjnych, mg-ekw Ba, związana z 1 g kwasu humusowego | Ilość grup karboksylowych, mg-ekw Ca, związana z 1 g kwasu humusowego | Pojemność wymienna na 100 g bezwzględnie suchej substancji bezpopiołowej, mg-ekw |
|---|---|---|---|
| Kwasy humusowe z: | |||
| Gleby darniowo-bielicowej | 5,91 | 2,89 | 289 |
| Gleby szarej zubiałej | 7,17 | 3,21 | 321 |
| Czarnoziemu słabo zubiałego | 7,57 | 4,05 | 405 |
| Czarnoziemu zwyczajnego | 8,32 | 5,11 | 511 |
| Gleby ciemnokasztanowej | 8,22 | 4,20 | 420 |
| Czarnoziemu południowego węglanowego | 6,65 | 3,79 | 379 |
| Gleby brązowej | 5,57 | 2,22 | 222 |
Z danych tabeli widać, że zawartość grup funkcyjnych zdolnych do reakcji wymiennych wzrasta od gleby darniowo-bielicowej do czarnoziemów; przy przejściu do gleb ciemnokasztanowych i brązowych zmniejsza się. Wszystkie powyższe różnice w składzie i właściwościach kwasów humusowych różnego pochodzenia w znacznym stopniu determinują rolę tych ostatnich w procesach glebowych, a także ich wpływ na organizm roślinny.
Aktywność fizjologiczna kwasów humusowych różnych gleb Ukrainy
Rozpuszczalne sole kwasów humusowych z metalami jednowartościowymi są przyswajane przez rośliny i wywołują określony efekt fizjologiczny, pobudzając wzrost, przede wszystkim systemu korzeniowego, a następnie masy nadziemnej. Wpływ kwasów humusowych jest najbardziej widoczny w początkowym okresie rozwoju roślin. Nasi naukowcy uważają, że aktywność fizjologiczna kwasów humusowych jest bezpośrednio związana z określoną budową ich cząsteczki i, przede wszystkim, z obecnością w nich grup chinoidowych i polifenolowych.
Aktywność fizjologiczną kwasów humusowych określano poprzez eksperymenty z jęczmieniem na ubogiej mieszance Prianishnikova, z której wykluczono wapń i żelazo, ponieważ koagulują one kwas humusowy i przekształcają go w stan fizjologicznie nieaktywny. Ponieważ eksperymenty były krótkotrwałe, zakładano, że zapas tych pierwiastków zawarty w nasionach będzie wystarczający. Precypitat w mieszance Prianishnikova zastąpiono mieszaniną buforową Sorensena o pH równym 6,8–7.
Eksperyment przeprowadzono według następującej metodyki. Do mieszanki Prianishnikova (rozcieńczonej wodą 1:1) dodawano określone ilości roztworów kwasów humusowych do stężenia 0,001%. Kiełki nasion sadzono w zlewkach chemicznych o pojemności 700 ml po dwie rośliny w każdej. Powtórzenie eksperymentu trzykrotne. Pomiar roślin doświadczalnych przeprowadzano po dwóch tygodniach. Dla sprawdzenia powtarzalności takie eksperymenty zakładano czterokrotnie.
| Obiekty badań | Eksperyment 1 | Eksperyment 2 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Średnia długość korzenia pierwszego rzędu, mm | W stosunku do kontroli, % | Średnia wysokość części nadziemnej, mm | Liczba korzeni drugiego rzędu | W stosunku do kontroli, % | |
| Kontrola — uboga mieszanka Prianishnikova (Tło) | 44±1 | 100 | 179 | 16 | 100 |
| Tło + kwas humusowy z gleby darniowo-bielicowej | 67±5 | 152 | 201 | 36 | 127 |
| Tło + kwas humusowy z gleby szarej zubiałej | 87±9 | 198 | 190 | 39 | 158 |
| Tło + kwas humusowy z czarnoziemu zubiałego | 103±2 | 234 | 201 | 44 | 186 |
| Tło + kwas humusowy z czarnoziemu zwyczajnego | 107±3 | 243 | 203 | 39 | 172 |
| Tło + kwas humusowy z gleby ciemnokasztanowej | 97±4 | 220 | 211 | 41 | 193 |
| Tło + kwas humusowy z czarnoziemu południowego węglanowego | 85±5 | 193 | 195 | 51 | 146 |
| Tło + kwas humusowy z gleby brązowej | 86±8 | 195 | 220 | 40 | 141 |
Z przedstawionych danych widać, że największą aktywnością fizjologiczną charakteryzują się kwasy humusowe czarnoziemów i gleb ciemnokasztanowych, mające bardziej skondensowany pierścień aromatyczny. Kwasy humusowe gleby darniowo-bielicowej i brązowej, mniej skondensowane i bardziej zdyspergowane, wykazują mniejszą aktywność fizjologiczną. Roztwory kwasów humusowych czarnoziemu wywierają silniejsze stymulujące działanie na oddychanie korzeni niż roztwory kwasów humusowych z torfu.
Naukowcy poddali hydrolizie kwas humusowy torfu i ustalili, że humat potasu niehydrolizującego resztu wykazuje większą aktywność fizjologiczną w porównaniu z hydrolizatami. Ich zdaniem, rdzeń kwasów humusowych odgrywa wiodącą rolę w stymulacji ich wpływu na procesy biochemiczne i cały organizm roślinny.
Dla pełniejszej charakterystyki wpływu kwasów humusowych różnych gleb na organizm roślinny założono eksperyment w kulturze piaskowej z rośliną wskaźnikową — pomidorami. Kwasy humusowe wprowadzano w postaci roztworów humatu potasu w ilości 0,22 g kwasu humusowego na naczynie. Eksperyment przeprowadzono według schematu: 1. Kontrola — pełna mieszanka Prianishnikova (tło). 2. Tło + 0,22 g kwasu humusowego na naczynie. Powtórzenie eksperymentu trzykrotne. Zbiór przeprowadzono po 4 tygodniach od pojawienia się siewek. W roślinach określano świeżą masę, aktywność enzymu peroksydazy metodą Poczynka, cukry redukujące metodą Hagedorna-Jensena, chlorofil metodą Guthriego, witaminę C metodą Murriego. Po zbiorze w kulturze piaskowej określano całkowitą ilość mikroorganizmów rosnących na MPA, azotany z kwasem disulfofenolowym metodą Grandvala-Lajoux, ruchomy fosfor metodą Truoga. Wyniki analiz przedstawiono w tabeli 4.
| Obiekty badań | Wpływ kwasów humusowych na rośliny | Wpływ kwasów humusowych na glebę | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Masa 100 siewek (substancja świeża), g | W stosunku do kontroli, % | Aktywność peroksydazy, mg kobaltu | Ilość chlorofilu na 100 g substancji świeżej, mg | Ilość kwasu askorbinowego na 100 g substancji świeżej, mg | Suma cukrów, % | Ilość mikroorganizmów na MPA, tys. na 1 g suchej gleby | Ilość NO₃ na 100 g suchej gleby, mg | |
| Kontrola — mieszanka Prianishnikova (Tło) | 32,6 | 100 | 13,00 | 109,58 | 22,4 | 0,50 | 1760 | 4,16 |
| Tło + kwas humusowy z: | ||||||||
| Gleby darniowo-bielicowej | 40,88 | 125 | 14,16 | 121,76 | 24,8 | 0,58 | 2090 | 4,54 |
| Gleby szarej zubiałej | 47,63 | 146 | 16,20 | 121,76 | 27,2 | 0,77 | 2280 | 4,90 |
| Czarnoziemu zubiałego | 48,22 | 148 | 16,20 | 126,42 | 29,6 | 0,85 | 2750 | 6,09 |
| Czarnoziemu zwyczajnego | 49,79 | 153 | 16,20 | 131,50 | 30,4 | 0,95 | 2886 | 6,35 |
| Gleby ciemnokasztanowej | 62,46 | 192 | 16,20 | 131,50 | 33,0 | 0,85 | 2640 | 7,14 |
| Czarnoziemu południowego węglanowego | 41,66 | 128 | 14,60 | 121,76 | 27,0 | 0,90 | 2616 | 6,66 |
| Gleby brązowej | 36,53 | 112 | 14,60 | 121,76 | 25,6 | 0,78 | 1932 | 4,54 |
Z danych tabeli widać, że bardziej „dojrzałe” pod względem genetycznym kwasy humusowe czarnoziemów i gleb ciemnokasztanowych są fizjologicznie bardziej aktywne. Pod ich wpływem zwiększa się masa zielona siewek, wzrasta aktywność enzymów oddechowych, zwiększa się akumulacja w roślinach cukrów, kwasu askorbinowego i chlorofilu w większym stopniu niż pod wpływem mniej skondensowanych kwasów humusowych gleby darniowo-bielicowej i brązowej. W wariantach z kwasami humusowymi z czarnoziemów i gleb ciemnokasztanowych kultury piaskowe zawierały więcej mikroorganizmów i substancji odżywczych. Bardziej „dojrzałe” kwasy humusowe wywierają większy stymulujący wpływ na pobieranie przez pomidory składników pokarmowych, dzięki czemu zwiększa się masa siewek i pobieranie składników pokarmowych.
Wnioski
- Kwasy humusowe różnych typów gleb charakteryzują się nierównymi właściwościami, co w znacznym stopniu determinuje rolę substancji humusowych w procesach glebowych, a także ich wpływ na organizm roślinny. Bardziej „dojrzałe” pod względem genetycznym kwasy humusowe czarnoziemów i gleb ciemnokasztanowych, mające bardziej skondensowany pierścień aromatyczny, wywierają silniejsze stymulujące działanie na procesy biologiczne w glebach i na rośliny w porównaniu z mniej skondensowanymi kwasami humusowymi gleby darniowo-bielicowej i brązowej.
- Działanie kwasów humusowych jest związane, jak się wydaje, z całkowitą zawartością w nich grup funkcyjnych.
- Jednym z czynników większej efektywności nawozów humusowych na glebach darniowo-bielicowych i brązowych jest, prawdopodobnie, mniejsza aktywność fizjologiczna kwasów humusowych tych gleb.