Rozdział humusów na kwasy huminowe i fulwowe na ich frakcje i ich aktywność biologiczna

Na podstawie badań ustalono jednoznacznie, że główne jednostki strukturalne cząsteczki kwasu huminowego połączone są ze sobą prostymi wiązaniami eterowymi. Ten ostatni można hydrolizować.

Jak się powszechnie uważa, w wyniku hydrolizy cząsteczka kwasu huminowego rozpada się na składowe elementy strukturalne. Substancje szeregu alifatycznego, stanowiące część obwodową kwasu, połączone z rdzeniem prostymi wiązaniami eterowymi, przechodzą do roztworu. Jądra kwasów huminowych, zdaniem większości badaczy, nie ulegają hydrolizie i dlatego, uwolnione od łańcuchów peryferyjnych, powinny pozostać w osadzie.

W naszych badaniach skorzystaliśmy z tej możliwości i wyizolowaliśmy poszczególne frakcje kwasów huminowych według schematu pokazanego na rys. 1.

Metodologia badań

Suchy preparat humusowy , który następnie poddano hydrolizie, uzyskano z torfu. Kwasy huminowe i fulwowe ekstrahowano z torfu przez gotowanie z 3% NaOH, po czym wytrącano je 10% HCl. Żel kwasu huminowego zbierano na filtrze, przemywano wodą aż do uzyskania ujemnego wyniku testu chlorowego, a następnie ponownie wytrącano, suszono w temperaturze 45–60°C, mielono na proszek i w tej formie stosowano w eksperymentach.

Hydrolizę kwasu huminowego przeprowadzono w taki sam sposób, jaki stosuje się w przypadku białek. Próbkę kwasu o masie 1 g umieszczono w probówce wypełnionej 10 ml 6 N HCl, probówkę zamknięto i umieszczono w piecu suszarniczym na 6 godzin w temperaturze 125-130°C.

Czyszczenie frakcji

Po hydrolizie produkty rozpadu wyekstrahowano z ampułki. Jądra kwasów huminowych (pozostałość po hydrolizie) oddzielono od hydrolizatu przez filtrację. Ponieważ obie frakcje zawierały dużo chloru i miały być badane w eksperymencie w naczyniu, wymagały wstępnego oczyszczenia. Uzyskane frakcje poddano różnym metodom oczyszczania.

Frakcja nr 1

Pozostałość po hydrolizie, która w przeciwieństwie do pierwotnego kwasu huminowego była całkowicie czarna i słabo rozpuszczalna w alkaliach, przemywano na filtrze aż do uzyskania ujemnego wyniku testu na obecność chloru. Następnie przygotowano z niego humat sodowy. Do pobrania 100 mg pozostałości nieulegającej hydrolizie pobrano 2 ml 0,1 N NaOH. W postaci takiego związku frakcja ta została użyta w eksperymencie i zgodnie z naszymi założeniami scharakteryzowała właściwości fizjologiczne rdzenia kwasu huminowego.

Ułamki #2 i #3

Oczyszczenie hydrolizatu z kwasu solnego okazało się trudniejsze. Przetestowaliśmy znaną w literaturze metodę oczyszczania hydrolizatu z chloru poprzez wielokrotne odparowywanie w próżni (frakcja nr 2). Ponieważ jednak część soli mineralnych przedostała się do hydrolizatu, powodując powstanie chlorków, całkowite pozbycie się chloru okazało się niemożliwe. Dlatego przetestowano również inne metody czyszczenia i uznano je za korzystniejsze. Jedną z metod jest dializa hydrolizatu w celofanowym woreczku, przeciwprądowo, aż do momentu zniknięcia próbki chloru z wody płuczącej. Po dializie w worku pozostał barwny roztwór, który wykorzystano w eksperymencie (frakcja nr 3) oraz niewielki osad, który usunięto. Osad był szczególnie widoczny, gdy hydrolizat przed dializą zneutralizowano wodorotlenkiem sodu (frakcja nr 3-a).

Separacja chromatograficzna

Oryginalnym podejściem do badania składu substancji humusowych jest ich chromatograficzne rozdzielenie na węglu aktywnym, a następnie wymywanie zaadsorbowanych związków różnymi rozpuszczalnikami. Tę metodę w przypadku tych substancji po raz pierwszy zaproponował Forsyth (1947), a następnie z powodzeniem zastosowali ją Dragunov i Khan.

Później pojawiły się prace Drozdowej, która opracowała metodę oczyszczania kwasów fulwowych poprzez frakcjonowanie na węglu. Zastosowaliśmy tę technikę, biorąc pod uwagę, że oczyszczanie kwasów fulwowych z kwaśnego roztworu i oczyszczanie kwaśnego hydrolizatu mają wiele wspólnego. Hydrolizat, podobnie jak kwasy fulwowe, ma kolor pomarańczowy i jest rozpuszczalny w zasadach i kwasach. Podczas neutralizacji, w momencie zmiany koloru, kongorot częściowo tworzy osad, który po dalszej alkalizacji lub zakwaszeniu ponownie przechodzi do roztworu.

Ułamki #4, #5 i #6

Związki o charakterze niearomatycznym, takie jak aminokwasy, aminocukry, alkohole cukrowe, węglowodany, kwasy uronowe itp., również przechodzą do hydrolizatu kwasu huminowego, którego aktywność również wymagała zbadania. Stosując metodę Forsythe'a, zmodyfikowaną przez Drozdową, udało się rozdzielić hydrolizat na co najmniej dwie frakcje i każdą z nich zbadać oddzielnie.

W tym celu hydrolizat przepuszczono przez warstwę węgla aktywnego. Roztwór przechodzący przez węgiel był bezbarwny i zawierał, według Drozdowej, sole nieorganiczne, kwas solny, aminokwasy, zasady azotowe, proste węglowodany itp. Roztwór ten, o ile było to możliwe, zagęszczano i oczyszczano z chloru pod próżnią, a następnie wprowadzano do eksperymentu (frakcja nr 4). Barwne substancje z hydrolizatu, zaadsorbowane na węglu, usunięto za pomocą mieszaniny acetonu i zasady. Następnie z eluatu oddestylowano aceton, pozostałość dializowano w worku celofanowym do momentu, aż woda płucząca nie zawierała fenoloftaleiny i została wykorzystana w eksperymencie (frakcja nr 5). Frakcja ta miała cytrynowożółtą barwę w środowisku kwaśnym i pomarańczową barwę w środowisku zasadowym. Przez analogię do oczyszczania kwasów fulwowych można założyć, że frakcja zaadsorbowana na węglu zawiera substancję o charakterze chinoidowym, gdyż nie reagowała dodatnio z α-naftolem, odczynnikiem Millona i chlorkiem żelazowym, lecz zmieniała kolor w zależności od reakcji ośrodka i miała ostry, chlorowy zapach.

Należy zauważyć, że w celu uniknięcia ewentualnych strat podczas desorpcji i dializy, określoną frakcję hydrolizatu badano również bezpośrednio w formie zaadsorbowanej na węglu. W tym przypadku po przepuszczeniu przez nią hydrolizatu węgiel aktywny został wypłukany z chloru, wysuszony, rozdrobniony i użyty w eksperymencie (frakcja nr 6).

Wyniki badań

Przebadano aktywność biologiczną frakcji otrzymanych powyższą metodą oraz oryginalnego kwasu huminowego w postaci humatu potasowego w kulturach wodnych. Jako kontrolę zastosowano wodę destylowaną.

Do naczynia o pojemności 0,5 litra dodano 4–6 mg preparatów kwasu huminowego. W ten sam sposób wprowadzano substancje zaadsorbowane na węglu aktywnym. Tabela 1 przedstawia wpływ różnych frakcji kwasów huminowych na wzrost korzeni jęczmienia, pszenicy i pomidorów.

Dane te wskazują, że fragmenty cząsteczek kwasu huminowego są biologicznie aktywne. Humian potasu przygotowany z pozostałości nieulegających hydrolizie nie jest gorszy od standardowego roztworu humianu potasu w stymulowaniu wzrostu korzeni. Zatem rdzeń kwasu huminowego odgrywa oczywistą rolę w stymulowaniu wzrostu korzeni. Jednocześnie w eksperymencie odnotowano dość silną stymulację przez substancje, które po hydrolizie ulegają adsorpcji na węglu. Jeżeli weźmiemy pod uwagę, że substancje te są związkami polifenolowymi i chinonowymi, to efekt uzyskany w eksperymencie można wytłumaczyć ich bezpośrednim wpływem na roślinę.

Zauważyliśmy również, że sam węgiel aktywny, jako adsorbent, również powoduje zwiększony wzrost korzeni. Niektórzy badacze tłumaczą ten efekt zdolnością węgla do adsorpcji jonów wodorowych uwalnianych przez system korzeniowy, dzięki czemu węgiel wspomaga proces oddychania i odżywiania mineralnego roślin. P. A. Vlasyuk na przykład zaleca dodanie do rzędów węgla brunatnego jako adsorbentu, który zmniejsza stężenie soli w strefie korzeniowej i poprawia odżywienie upraw.

Dlatego w eksperymencie z pomidorami wykorzystaliśmy węgiel aktywowany, który przed eksperymentem umyliśmy mocnym kwasem solnym, następnie odmyliśmy go z chloru, część wykorzystaliśmy do adsorpcji hydrolizatu, a pozostałą część wprowadziliśmy do eksperymentu w czystej postaci. Porównując długość wzrostu korzeni pszenicy, jęczmienia i pomidorów, można zauważyć, że węgiel aktywny zawiera zanieczyszczenia, które mogą zniekształcać wyniki badania, gdyż wspomagają wzrost korzeni. Substancja zaadsorbowana na węglu w tym przypadku okazuje się także biologicznie aktywna.

Na podstawie tego eksperymentu można się również przekonać, że sam kwas huminowy w postaci drobno zmielonego żelu nie wykazuje żadnego efektu jako adsorbent. Adsorbenty te w rzeczywistości mają różne właściwości, ponieważ mają różną pojemność absorpcyjną (Tabela 2).

Porównanie zdolności absorpcyjnych węgla i żelu kwasu huminowego pokazuje, że gdyby pozytywny wpływ węgla na wzrost korzeni w naszych eksperymentach wytłumaczyć zdolnością adsorpcyjną, żel kwasu huminowego również byłby skuteczny, chociaż w rzeczywistości nawet nieznacznie hamował wzrost korzeni.

Poniżej (Tabela 3) przedstawiono wyniki eksperymentu, w którym badano frakcje kwasów huminowych po desorpcji z węgla aktywnego.

Wnioski

Z tych eksperymentów wynika, że ​​mieszanina produktów hydrolizy (frakcja nr 2) jest bardziej aktywna niż frakcja substancji, która nie jest adsorbowana na węglu i która prawdopodobnie zawiera łańcuchy peryferyjne kwasów huminowych. W związku z tym aktywność biologiczna kwasów huminowych zależy w oczywisty sposób od frakcji, która ulega adsorpcji na węglu i która, zgodnie z szeregiem cech, posiada strukturę polifenolową.

Wstępna neutralizacja hydrolizatu za pomocą zasady przed dializą prowadzi do zmniejszenia efektu pobudzającego, prawdopodobnie z powodu faktu, że w wyniku neutralizacji substancje czynne przechodzą do osadu, który jest usuwany po dializie.