Фракционирование гумусовых веществ леонардита и их активность

Гуминовые вещества не являются химически индивидуальными соединениями, а представляют собой смесь веществ различного происхождения, различающихся по молекулярному весу и химическому строению, и в то же время более или менее близких по своим свойствам. Поэтому, применяя разнообразные приемы, их можно разделить на ряд фракций, отличающихся по физико-химическим и биологическим свойствам.

Фракционирование гумусовых веществ производят: с помощью различных растворителей, путем дробного осаждения из растворов поливалентными катионами при различных значениях pH, извлечением их из исходного сырья щелочными растворами возрастающей концентрации, применением электрофореза и хроматографии, разделением на сефадексах и т.д. Большинство исследователей производят разделение гумусовых веществ с целью изучения их строения, происхождения и физико-химических свойств. В нашу задачу входит изучение физиологической активности.

Так как в большинстве случаев первой стадией разделения гумусовых веществ является их извлечение из сырья (торфа, угля, леонардита и т. д.) с помощью какого-либо растворителя, то мы решили вначале изучить физиологическую активность фракций леонардита Замглайского месторождения Черниговской области, полученных при применении различных растворителей.

Нами были получены бензольная, спиртовая, водная и щелочная фракции. Последняя была разделена на фульвокислоты, гиматомелановые кислоты и гуминовые кислоты. Характеристика их приведена в таблице 1.

Физиологическая активность фракций в концентрации 0,005% проверялась по трем тестам: изучалось влияние их на рост проростков ячменя, на прирост ячменя и размножение клеток дрожжей. Результаты опытов приведены в таблицах 2, 3 и 4.

Анализируя результаты опытов, можно отметить следующее:

• Все фракции органического вещества леонардита оказали заметное влияние на рост корней ячменя. Несколько сильнее оно было у фракции гуминовые кислоты и слабее у гиматомелановых кислот.
• Проявление стимулирующего действия фракций на рост надземной массы было примерно равным и более слабым, что можно объяснить краткосрочностью опытов, которые длились 10—12 дней, считая с момента посадки проросших семян на растворы.
• Ауксиновая активность фракций, по сравнению с гетероауксином, сравнительно невелика: она несколько выше у гиматомелановых кислот и ниже у бензольной и спиртовой фракций.
• Все фракции оказали довольно значительное действие на размножение клеток дрожжей, но особенно велико оно у водной фракции и фульвокислот.

Наибольшей, по содержанию в леонардите и по количеству при извлечении, является фракция гуминовых и фульвовых кислот. А так как они же, по предварительным данным, оказывают наиболее сильное регулирующее действие на рост и развитие высших растений, то именно с этой фракции и было решено начать более полное изучение гумусовых веществ леонардита.

Для фракционирования гуминовых кислот мы применили два метода. По первому методу навеска леонардита заливалась пятикратным по объему 0,1 н раствором KOH и настаивалась в течение суток при постоянном перемешивании. После отстаивания раствор сливался в бутыль, а осадок вновь заливался таким же раствором щелочи и операция извлечения повторялась. После 4—5-кратного извлечения весь раствор был слит вместе и с помощью изменения величины pH и центрифугирования был разделен на восемь более узких фракций. Условия их выделения и характеристика приведены в таблице 5. Следует отметить, что при растворении первых двух фракций раствор получается слегка мутным.

Определение физиологической активности растворов фракций концентрацией 0,005%, так же как и в предыдущих случаях, производилось по трем тестам (таблицы 6, 7 и 8).

Сравнивая физиологическое действие фракций гуминовых кислот (табл. 6) с действием фракций органического вещества леонардита, приведенным в табл. 2, на рост проростков ячменя, можно отметить, что на рост надземной массы все фракции влияют примерно одинаково. Что же касается корневой системы, то две фракции гуминовых кислот (3 и 4), в двух опытах из трех, оказали более сильное влияние на ее рост, чем все остальные, действие которых было примерно равным, но чуть ниже действия нерасфракционированного гумата калия (стандарт). Ауксиновая активность фракций гуминовых кислот, по сравнению с гетероауксином, незначительна и равна рассмотренным выше фракциям.

Добавление к среде Ридер растворов фракций гуминовых кислот резко усилило размножение дрожжей. Особенно это заметно у фракции № 8, которая по своим свойствам приближается к фульвокислотам. Однако наибольшую активность проявил нерасфракционированный гумат калия (стандарт). Это, очевидно, объясняется тем, что в его состав входят и водорастворимые вещества и фульвокислоты, которые в предыдущем опыте (табл. 4) показали наилучшие результаты.

Однако установить зависимость величины физиологической активности фракций от содержания или количества тех или иных функциональных групп не представляется возможным. Это осложняется не только тем, что активность фракций меняется по отношению к разным тестам, но и тем, что она не остается стабильной при повторении опытов с одними и теми же тестами: в одних опытах активность какой-либо фракции может быть выше, чем активность других, в других же опытах — несколько ниже. По всей вероятности, физиологическая активность фракций органического вещества леонардита зависит не столько от наличия и количества функциональных групп, сколько от молекулярной структуры входящих в их состав химических соединений.

В качестве второго метода выделения гуминовых кислот мы использовали способ последовательного извлечения их из леонардита 0,02 н раствором KOH. Леонардит заливался пятикратным по объему количеством щелочного раствора и настаивался в течение суток при постоянном перемешивании. После отстаивания раствор центрифугировался в течение получаса при 3000 оборотах в минуту и сливался в стеклянную бутыль, в которой извлеченная фракция гуминовых кислот осаждалась соляной кислотой. Полученный осадок с помощью центрифугирования отделялся и промывался дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, а затем высушивался при температуре 40°С.

Оставшийся леонардит вновь заливался пятикратным по объему количеством щелочного раствора, указанной выше концентрации, и вся операция извлечения повторялась. Таким образом, нами была выделена 31 фракция гуминовых кислот. Характеристика их приводится в таблице 9.

Из таблицы видно, что физико-химические свойства фракций неодинаковы. Первые фракции имеют значительно больше активных кислых групп и несколько большую оптическую плотность, чем последние.

Физиологическая активность фракций проверялась в опыте с озимой пшеницей. Семена пшеницы в течение суток проращивались, а затем пересаживались на дистиллированную воду (контроль) и растворы фракций гуминовых кислот концентрацией 0,003%. Для получения растворов фракций гуминовых кислот концентрацией 0,003% навеска сухого вещества фракции в количестве 30 мг (в пересчете на абсолютно сухое беззольное вещество) растиралась в ступке с двумя миллилитрами 0,1 н KOH, а затем доводилась дистиллированной водой до одного литра.

На растворах проростки пшеницы выращивались в течение 10 дней. Затем опыт прекращался и определялась длина корней и листьев растений, а также их сырой и сухой вес.

По результатам опыта (табл. 10) можно видеть, что под влиянием растворов фракций гуминовых кислот увеличивались длина корней и листьев, по сравнению с контролем, а также сырой и сухой вес проростков пшеницы. Это свидетельствует не только об усилении деления и роста клеток растений, но и процессов синтеза в них. Влияние отдельных фракций гуминовых кислот на рост корней, листьев и накопление сухого вещества проростками пшеницы не одинаково. Прирост длины корней колеблется от 20 до 70%, листьев — от 16 до 32, накопление сухого вещества — от 7 до 32%. Но различия в силе действия между фракциями, в отличие от фракций, выделенных путем изменения величины pH и центрифугирования (табл. 6), невелики и при повторении опытов так же, как и в описанных выше случаях, не остаются стабильными как по абсолютной величине, так и по отношению друг к другу, хотя стимулирующее свойство фракций во всех случаях сохраняется.

Известно, что слабые растворы гуминовых кислот в любых условиях оказывают влияние на ход биохимических процессов в растениях и являются своеобразными регуляторами их роста и развития. Особенно же резко оно проявляется при наличии питательных веществ, но в условиях неблагоприятных для их усвоения.

Примером этому может служить опыт, поставленный нами с томатами сорта «Киевские». Неблагоприятным фактором в этом опыте являлась дистиллированная вода с pH равным 5,8. Питательная смесь Коссовича была приготовлена на этой же воде и имела ту же величину pH. Семена томатов проращивались на воде. Через четыре дня наклюнувшиеся семена были высажены на дистиллированную воду, смесь Коссовича и растворы фракций гуминовых кислот, а еще через 10 дней проведены замеры длины корней и стеблей и определен сырой и сухой вес проростков. Результаты опытов представлены в таблице 11.

При выращивании проростков томатов на дистиллированной воде с pH 5,8 их корневая система и надземная часть были сильно угнетены. Добавление различных фракций гуминовых кислот несколько увеличило прирост корней и стеблей, но сухой вес проростков изменился очень мало из-за отсутствия в растворах необходимых питательных элементов для синтеза белковых веществ клеток.

Совершенно иную картину мы видим при выращивании проростков томатов на питательной смеси Коссовича с добавлением к ней растворов фракций гуминовых кислот, несмотря на то, что величина pH в растворах не изменилась и оставалась равной pH дистиллированной воды. Если на смеси Коссовича прирост корней, стеблей и сухого вещества незначительно возросли по сравнению с дистиллированной водой, то при добавлении к смеси гуминовых кислот не только резко усилился рост корней и стеблей, но и значительно увеличилось накопление сухого вещества проростками.

Таким образом, можно сделать вывод, что фракции органического вещества леонардита обладают стимулирующими свойствами. Характер и сила действия фракций зависит как от молекулярной структуры веществ, входящих в их состав, и особенностей организма, на который они действуют, так и от условий внешней среды. Сила их действия увеличивается при неблагоприятных условиях и уменьшается в благоприятных. При применении соответствующих методов разделения представляется возможным получение более узких фракций или даже индивидуальных соединений, обладающих специфической физиологической активностью.