О природе физиологической активности гумата
Влияние физиологически активных форм гуминовых кислот и близких к ним соединений, например полифенолов, на оксидативный обмен можно считать твердо установленным фактом. Объяснение этому явлению разные исследователи дают различное. Мы же в течение многих лет высказывали мнение, что главное здесь кроется в том, что хинонные группы этих соединений, являясь переносчиком водорода от окисляемого объекта к кислороду, усиливают важнейшую транспортную систему передачи электронов и, таким образом, снимают кислородную недостаточность в клетках, которая, как показывают наблюдения, создается чаще, чем это принято думать. Все это приводит к усилению энергетического потенциала растений, что экспериментально подтверждается измерением биоэлектрического потенциала — БЭП, показателями термодинамического состояния растений и положительно сказывается на обмене веществ в организме.
Одним из наиболее смелых биохимиков Сент-Дьерди высказывал идею, что все биохимические процессы — это постепенный спуск электрона, поднятого на более высокий уровень в результате поглощения кванта света при фотосинтезе. Бернард и Альберта Пюльманы, в свою очередь, говорили: «Динамичность жизни согласуется с динамичностью электронного облака в сопряженных молекулах...». Главной особенностью этих молекул они считали наличие в них делокализованных электронов, которые придают молекуле дополнительную стабильность, устойчивость против излучений, возможность передачи электронного возбуждения на большие расстояния, возможность переноса электрона и энергии и др.
Делокализованные или неспаренные электроны приобрели такое значение потому, что они возбуждаются легче, чем спаренные. Возбуждение электрона, то есть перенос его с более низкого энергетического уровня на более высокий, определяется поглощением кванта видимого или ультрафиолетового света. Обратный процесс сопровождается выделением кванта и высвечиванием света, то есть люминесценцией. Такой перенос электрона как бы соответствует внутримолекулярному уровню окислительно-восстановительного процесса. Межмолекулярный перенос делокализованного электрона связан уже с окислительно-восстановительными процессами на межмолекулярном уровне, то есть с дыханием. Совершенно очевидно, что оба эти процесса взаимосвязаны и, поскольку влияние гуминовых и фульвовых кислот на процессы дыхания — факт, установленный твердо, можно предполагать, что влияют они и на возбуждение электрона.
Есть основание полагать, что физиологически активные формы гуминовых и фульвовых кислот, поступив в растения, оказывают влияние на настройку энергетических уровней делокализованных электронов сопряженных молекул и, таким образом, затрагивают важнейшие жизненные процессы. Если это предположение правильно, то, во-первых, физиологически активные гуматы должны способствовать лучшему поглощению солнечной энергии, причем их эффективность в разных лучах спектра должна быть различной; во-вторых, они должны оказывать влияние на парамагнитные свойства растительных тканей; в-третьих, под влиянием гуматов должны усиливаться их люминесцентные свойства. Не задаваясь целью выявить количественную сторону этих процессов и вскрыть его механизм, мы предприняли это исследование лишь для того, чтобы экспериментально проверить высказанное предположение.
Методика исследований
Для решения поставленных задач проводили краткосрочные микровегетационные опыты в условиях различного спектра. Методика опытов следующая: семена кукурузы и маша помещали в проращиватели, замачивали растворами согласно схеме опыта и ставили в темный термостат. Затем пяти-, семидневные этиолированные проростки пересаживали в стаканы емкостью 500 мл по 5 растений в каждый, на среду соответственно схеме опыта и помещали под световую установку в отсеки с различными цветными экранами. Освещалась установка лампами дневного света 3500 лк/м². Экраны готовили путем нанесения цветных пленок, полученных по методу Гродзинского, на стекло размером 36 × 48 см. Их спектральную характеристику определяли на СФ-4А.
В схему опыта включали гумат калия, который испытывали в концентрациях 3.1⋅10⁻⁵ моль/л и АТФ — 1.4⋅10⁻⁵ моль/л (последняя в качестве дополнительного контроля как соединение, богатое энергией). Средой была либо обедненная смесь Прянишникова, в которой фосфор давали в виде буферной соли Серенсена, либо дистиллированная вода. Опыт закладывали в трехкратной повторности. Он продолжался в течение 7 дней, после чего растения измеряли, взвешивали и анализировали по следующим показателям: хлорофилл по Гетри, нуклеиновые вещества по методу Нетубской и Курамшина. Было заложено 27 таких опытов.
Для выяснения вопроса — влияют ли растворимые гуматы на парамагнитные свойства растительных тканей — был использован метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Как известно, сущность метода ЭПР состоит в резонансном поглощении высокочастотной электромагнитной энергии объектом при строго определенных соотношениях напряженности магнитного поля и частоты. Метод ЭПР основан на известном эффекте Зеемана, заключающегося в том, что при введении парамагнитной частицы, характеризуемой наличием неспаренного электрона и квантовым спиновым числом S, постоянное магнитное поле ее основной энергетический уровень расщепляется на 2S+1 подуровней, которые отделены друг от друга промежутками энергии:
ΔE=hν=gbH, где H — напряженность магнитного поля, ν — частота.
При подаче на парамагнитный образец, помещенный в постоянное магнитное поле «Н» высокочастотного (ВЧ или СВЧ) магнитного поля с перпендикулярной к Н ориентацией магнитного вектора, при частоте:
ν=hΔE=hgbH
с равной вероятностью индуцируются переходы между двумя соседними уровнями, где:
- g — фактор спектроскопического расщепления;
- b — магнетон Бора;
- h — постоянная Планка.
При этом происходит перераспределение населенности энергетических уровней в сторону их выравнивания, часть энергии СВЧ поля поглощается в образце и тратится на его нагревание. Задачей опыта при наблюдении явления ЭПР является точная регистрация поглощаемой образцом высокочастотной энергии. Многие ученые изучали явление электронного парамагнитного резонанса в целом ряде биологически активных соединений и в живых тканях и показали его эффективность для этой цели.
В качестве объекта наших исследований брали листья и корни пяти-, шестидневных проростков маша, выращенных в определенных условиях, и подвергали их лиофильной сушке после замораживания до температуры −70°. Сушили их в течение 24 часов до остаточного давления 10⁻³ мм рт. ст. Для исследования ЭПР навески высушенных листьев и корней в 3-5 мг помещали в тонкостенные кварцевые трубки диаметром 4-5 см, которые отжигали в ацетилено-кислородном пламени. Спектры ЭПР регистрировали в виде первой производной кривой резонансного поглощения. Содержание свободных радикалов в образце определяли сравнением эталона и площадей под интегральными кривыми резонансного поглощения исследуемого вещества, которые строили по дифференциальным кривым I′=f(H) при ν=const. Площади рассчитывали методом двойного графического интегрирования. В качестве эталона для измерения ширины линий исследуемых спектров служил γ-облученный аланин, а при определении площадей — γ-облученная сахароза. Для определения g-фактора использовали вакуумированные трубки с эталоном Mn++ в MgO, для которых точно известны значения g-фактора. Для приближенных расчетов площадей под интегральными кривыми пользовались формулами Симпсона.
Для того чтобы констатировать влияние гуминовой кислоты на люминесценцию растений, выращенных в различных условиях спектра, поступали следующим образом: навеску ткани листьев растирали с водой в соотношении 2:100 и оставляли на некоторое время. Потом к определенному объему отфильтрованной вытяжки добавляли по 1 мл флуоресцина 10⁻³ моль/л, облучали ультрафиолетовым светом (стекло Вуда) в течение 5 мин, после чего определяли относительную интенсивность флуоресценции.
Результаты исследований
Прежде всего проанализируем наиболее характерные данные, показывающие влияние гуминовых кислот и АТФ на накопление сырой массы в разных лучах спектра. Они показывают, что накопление сырой массы в проростках кукурузы было максимальным в красно-оранжевой и сине-фиолетовой части спектра, минимальным — в зеленой части. Аналогичной была и реакция растений на физиологически активные формы гуминовых кислот и АТФ.
Нетрудно увидеть, что реакция проростков кукурузы на физиологически активные вещества по образованию сырой массы повторяет кривую поглощения света хлорофиллом, что дает основание думать, что физиологически активные вещества влияют на фотохимические реакции фотосинтеза и способствуют лучшему поглощению энергии солнца. Этот опыт повторяли многократно и он давал близкие результаты с некоторым перемещением максимума накопления массы внутри фиолетовой части спектра. Маш оказался в этом отношении менее отзывчивым.
Влияние физиологически активных веществ сказывается не только на образовании сырой массы, но и на морфогенезе растений, причем оно отличается от влияния на вес. Оказалось, что корни относительно лучше реагируют на гуматы в сине-фиолетовом участке спектра, а листья — в красно-оранжевом.
Наблюдения над влиянием изучаемых факторов на содержание хлорофилла показали, что максимум реакции у кукурузы в этом отношении перемещается от коротковолновой части спектра к длинноволновой. В отдельных случаях пик получается в желто-зеленой части спектра. Реакция растений на изменение спектрального состава по количеству хлорофилла довольно постоянна и больше связана с интенсивностью света. Наблюдения над содержанием нуклеиновых кислот показывают, что действие физиологически активных веществ при различном качестве света, бесспорно, влияет на этот аппарат растительной клетки. Однако разноречивость данных в разных опытах не позволяет еще установить направление этого процесса.
Данные измерений ЭПР и соответствующие расчеты представлены в таблицах 1 и 2. Эти данные показывают, что ЭПР растительных тканей маша, подвергнутых лиофильной сушке, представлены одиночными линиями с g-фактором, близким к g-фактору свободного электрона (для листьев gср. равно 2.00388±0.0005 и ΔHср.−18.1±0.2 э; для корней gср.−2.00349±0.0005 и ΔHср.−13.5±0.2 э).
| Показатели | Семена проращены на | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Воде | Гумат калия | АТФ | 2,4-ДНФ | |||
| Проростки пересажены на | Воду | Гумат калия | АТФ | 2,4-ДНФ | ||
| ΔН э | 15,9 | 18,2 | 16,4 | 19,0 | ||
| g-фактор | 2,00441 | 2,00279 | 2,00489 | 2,00438 | ||
| S-интегральное (мм²) | 150 | 220 | 120 | 175 | ||
| Примечание. Для эталона γ-сахарозы, содержащей 10¹⁷ спинов/г, S-интегральное равно 455 мм². | ||||||
| Показатели | Семена проращены на | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| воде | гумате калия | АТФ | 2,4-ДНФ | |||
| Проростки пересажены на | воду | гумат калия | АТФ | 2,4-ДНФ | ||
| ΔН э | 11,2 | 14,5 | 16,3 | 9,6 | ||
| g-фактор | 2,00461 | 2,00440 | 2,00473 | 2,00380 | ||
| S-интегральное (мм²) | 20 | 40 | 60 | 12 | ||
Из сопоставления дифференциальных кривых следует, что гуматы калия и АТФ увеличивают амплитуду сигнала ЭПР, а 2,4-динитрофенол его тушит. Очень важно, что дополнительная пересадка растений с этого ингибитора на физиологически активные вещества в какой-то степени восстанавливает сигнал ЭПР, что коррелирует с физиологической реакцией растений на эти вещества. Аналогичным было влияние их и на интегральную кривую, что позволяет говорить об увеличении количества свободных радикалов под влиянием физиологически активных веществ. Важно отметить также, что количество свободных радикалов в листьях было гораздо больше, чем в корнях.
Физиологическое действие гуминовых кислот нужно связать с наличием в них свободных радикалов. Присутствие свободных радикалов в гуминовых кислотах почвы методом ЭПР было позднее показано работами в нашей лаборатории.
Степень люминесценции вытяжек из растений, выращенных в разных лучах спектра и получивших, и не получивших физиологически активные вещества, колеблется. Наметилась тенденция к увеличению эффекта в этом отношении от гуматов калия в красно-оранжевой части спектра. Влияние АТФ осталось неясным.
Выводы
- Полученные результаты прежде всего показывают, что реакция растений на физиологически активные формы гуматов в разных лучах спектра неодинакова: она больше в красно-оранжевой и сине-фиолетовой части, то есть в той части спектра, которая лучше поглощается хлорофиллом.
- Определение сигнала ЭПР в тканях маша показало, что под влиянием физиологически активных веществ в них увеличивается количество парамагнитных центров.
- Приведенные выше факты, а также изменение интенсивности люминесценции вытяжек из растений в присутствии флуоресцина позволяют предположить, что физиологически активные гуматы способствуют поглощению квантов света и оказывают влияние на настройку энергетического уровня делокализованных электронов сопряженных молекул, входящих в состав тканей растений.