На основании исследований твердо установлено, что основные структурные единицы молекулы гуминовых кислот соединены между собой простыми эфирными связями. Последние могут быть гидролизованы.
В результате гидролиза, как это принято сейчас считать, молекула гуминовой кислоты расщепляется на свои составные структурные элементы. В раствор переходят вещества алифатического ряда, представляющие собой периферическую часть кислоты, соединенную с ядром по типу простых эфирных связей. Ядра же гуминовых кислот, по мнению большинства исследователей, не подвергаются гидролизу и поэтому освобожденные от периферических цепочек должны оставаться в осадке.
В нашем исследовании мы воспользовались указанным положением и проводили выделение отдельных фракций гуминовых кислот по схеме, представленной на рис. 1.
Методика исследования
Препарат сухого гумата, который в дальнейшем подвергался гидролизу, получен из торфа. Гуминовые кислоты и фульвовые извлекались из торфа при кипячении 3-процентной NaOH, после чего осаждались 10-процентной HCl. Гель гуминовых кислот собирался на фильтре, промывался водой до отрицательной пробы на хлор, затем переосаждался, высушивался при температуре 45-60°C, размельчался в порошок и в таком виде использовался в опытах.
Гидролиз гуминовой кислоты производился так, как это принято для белков. Навеска кислоты в 1 г помещалась в пробирку, заливалась 10 мл 6 н HCl, пробирка запаивалась и помещалась в сушильный шкаф на 6 часов при температуре 125-130°C.
Очистка фракций
После гидролиза продукты распада извлекались из ампулы. Ядра гуминовых кислот (остаток после гидролиза) отделялись от гидролизата путем фильтрования. Поскольку обе фракции содержали много хлора, а их предполагалось испытывать в вегетационном опыте, требовалась их предварительная очистка. Применительно к полученным фракциям способ очистки был разный.
Фракция №1
Остаток после гидролиза, который имел в отличие от исходной гуминовой кислоты совершенно черный цвет и плохо растворялся в щелочи, промывался на фильтре до отрицательной пробы на хлор. Затем из него готовился гумат натрия. На 100 мг негидролизуемого остатка бралось 2 мл 0,1 н NaOH. В виде такого соединения эта фракция шла в опыт и по нашему предположению характеризовала физиологические свойства ядра гуминовых кислот.
Фракции №2 и №3
Очистка гидролизата от соляной кислоты оказалась более сложной. Нами был испробован известный в литературе способ очистки гидролизата от хлора путем многократного выпаривания под вакуумом (фракция № 2). Однако, поскольку в гидролизат переходила часть минеральных солей, в результате чего образовывались хлориды, окончательно избавиться от хлора оказалось невозможным. Поэтому были испытаны и другие методы очистки, которые оказались более предпочтительными. Одним из них является диализ гидролизата в целлофановом мешочке против тока воды до исчезновения пробы на хлор в промывных водах. После диализа в мешочке оставался окрашенный раствор, который поступал в опыт (фракция № 3), и небольшой осадок, который удалялся. Особенно заметным был осадок, когда перед диализом гидролизат нейтрализовался едким натрием (фракция № 3-а).
Хроматографическое разделение
Оригинальным подходом к изучению состава гуматных веществ является их хроматографическое разделение на активированном угле с последующей элюацией адсорбированных соединений различными растворителями. Впервые этот метод для указанных веществ предложил Форсайт (1947), а затем им успешно пользовались Драгунов и Хан.
Позже появилась работа Дроздовой, которая разработала методику очистки фульвокислот фракционированием на угле. Мы воспользовались этой методикой, считая, что очистка фульвокислот из кислого раствора и очистка кислого гидролизата имеют много общего. Гидролизат, как и фульвокислоты, имеет оранжевый цвет, растворим в щелочах и кислотах. При нейтрализации в точке перехода окраски конгорот частично выпадает осадок, который при дальнейшем подщелачивании или подкислении опять переходит в раствор.
Фракции №4, №5 и №6
В гидролизат гуминовых кислот переходят соединения и неароматической природы, такие как аминокислоты, аминосахара, сахароспирты, углеводы, уроновые кислоты и др., активность которых также необходимо было проверить. Пользуясь методом Форсайта в модификации Дроздовой, представлялась возможность разделить гидролизат по меньшей мере на две фракции и каждую из них в отдельности изучить.
Для этого гидролизат пропускался через слой активированного угля. Раствор, проходящий через уголь, был бесцветным и содержал, по данным Дроздовой, неорганические соли, соляную кислоту, аминокислоты, азотные основания, простые углеводы и др. Этот раствор, насколько оказалось возможным, был сгущен и очищен от хлора под вакуумом и затем поступил в опыт (фракция № 4). Окрашенные же вещества гидролизата, адсорбированные на угле, снимались смесью ацетона со щелочью. Затем из элюата отгонялся ацетон, остаток диализовался в целлофановом мешочке до отрицательной пробы промывных вод на фенолфталеин и шел в опыт (фракция № 5). Эта фракция в кислой среде имела лимонно-желтый цвет, а в щелочной - оранжевый. По аналогии с очисткой фульвокислот можно считать, что адсорбируемая на угле фракция содержит вещество хиноидного характера, поскольку положительной реакции с α-нафтолом, реактивом Миллона и хлорным железом оно не давало, но изменяло окраску в зависимости от реакции среды и обладало резким хлороподобным запахом.
Необходимо отметить, что во избежание возможных потерь при десорбции и диализе указанная фракция гидролизата испытывалась и непосредственно в адсорбированном на угле виде. При этом активированный уголь после пропускания через него гидролизата отмывался от хлора, сушился, измельчался и шел в опыт (фракция № 6).
Результаты исследований
Биологическая активность фракций, полученных указанным выше способом, и исходной гуминовой кислоты в виде гумата калия изучалась в водных культурах. В качестве контроля бралась дистиллированная вода.
В сосуд емкостью 0,5 литра вносилось 4-6 мг препаратов гуминовой кислоты. Из такого же расчета вносились и адсорбированные вещества на активированном угле. В таблице 1 показано влияние различных фракций гуминовой кислоты на рост корней ячменя, пшеницы и помидоров.
| Культуры | Вода | Гумат натрия (стандарт) | Гуминовая кислота как адсорбент | Активированный уголь как адсорбент | Гидролизат, адсорбированный на угле (фракция № 6) | Гумат калия из негидролизуемого остатка (фракция № 1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Пшеница | 51,2 | 391,6 | --- | 283,3 | 353,3 | 401,2 |
| Ячмень | 61,7 | 419,1 | --- | 286,6 | 401,2 | 423,3 |
| Томаты | 47,7 | 60,9 | 30,7 | 44,4 | 70,0 | --- |
Эти данные говорят о том, что осколки молекулы гуминовых кислот оказываются биологически активными. Гумат калия, приготовленный из негидролизуемого остатка, по стимуляции роста корней не уступает стандартному раствору гумата калия. Следовательно, ядру гуминовых кислот, очевидно, принадлежит ведущая роль в стимуляции роста корней. Вместе с тем в опыте отмечается также довольно сильная стимуляция веществами, которые после гидролиза адсорбируются на угле. Если учесть, что эти вещества относятся к полифенольным и хинонным соединениям, то полученный в опыте эффект можно объяснить непосредственным их влиянием на растение.
Нами было замечено также, что сам активированный уголь как адсорбент тоже вызывает усиленный рост корней. Некоторые исследователи такое действие объясняют способностью угля адсорбировать ионы водорода, выделяемые корневой системой, благодаря чему уголь способствует процессу дыхания и минеральному питанию растений. П. А. Власюк, например, рекомендует внесение в рядки бурого угля как адсорбента, который уменьшает концентрацию солей в зоне корней и улучшает питание культур.
Поэтому в опыте с томатами нами использовался активированный уголь, который перед постановкой опыта был промыт крепкой соляной кислотой, затем отмыт от хлора, часть его шла на адсорбцию гидролизата, а другая вносилась в чистом виде в опыт. При сравнении роста корней пшеницы, ячменя и томатов в длину можно видеть, что в активированном угле имеются примеси, которые могут исказить результаты исследований, так как способствуют росту корней. Адсорбированное же вещество на угле и в этом случае оказывается биологически активным.
Из этого опыта можно также убедиться, что сама гуминовая кислота в виде тонкорастертого геля в качестве адсорбента эффекта не дает. Эти адсорбенты действительно обладают разными свойствами, так как обладают разной емкостью поглощения (табл. 2).
| Адсорбент | Емкость поглощения (%) |
|---|---|
| Активированный уголь | 11,8 |
| Активированный уголь, обработанный HCl | 11,3 |
| Активированный уголь с адсорбированным гидролизатом | 10,6 |
| Гель гуминовой кислоты | 5,4 |
| Негидролизуемый остаток | 0,0 |
Сравнение емкостей поглощения угля и геля гуминовой кислоты показывает, что если бы в наших опытах положительное влияние угля на рост корней объяснялось адсорбционной способностью, гель гуминовой кислоты также оказался бы эффективным, в то время как на самом деле он даже немного угнетал рост корневой системы.
Ниже (табл. 3) приведены результаты опыта, в котором испытывались фракции гуминовых кислот после десорбции с активированного угля.
| Варианты опыта | Ячмень (опыт № 1) | Помидоры (опыт № 2) | Ячмень (опыт № 3) |
|---|---|---|---|
| Вода (контроль) | 116,6 | 47,7 | 295,0 |
| Гумат калия (стандарт) | 146,6 | 60,9 | 365,0 |
| Гидролизат после удаления хлора (фракция № 2) | --- | --- | 395,0 |
| Фракция гидролизата, десорбированная с активированного угля (фракция № 5) | 261,6 | 65,9 | --- |
| Фракция гидролизата, не адсорбируемая углем (фракция № 4) | --- | --- | 230,0 |
| Гидролизат после диализа (фракция № 3) | 131,6 | 62,1 | --- |
| Гидролизат после диализа с предварительной нейтрализацией (фракция № 3-а) | 183,3 | 53,6 | --- |
Выводы
Из этих опытов видно, что смесь продуктов гидролиза (фракция № 2) оказывается более активной, чем фракция веществ, которая не адсорбируется на угле и в которую предположительно входят периферические цепочки гуминовых кислот. Следовательно, биологическая активность гуминовых кислот, очевидно, зависит от той фракции, которая адсорбируется на угле и которая по ряду признаков имеет полифенольное строение.
Предварительная нейтрализация гидролизата щелочью перед диализом приводит к снижению стимуляционного эффекта, по-видимому, по той причине, что в результате нейтрализации активные вещества переходят в осадок, который после диализа был удален.