На підставі досліджень твердо встановлено, що основні структурні одиниці молекул гумінових кислот з'єднані між собою простими ефірними зв'язками. Останні можуть бути гідролізовані.
В результаті гідролізу, як це прийнято зараз вважати, молекула гумінової кислоти розщеплюється на складові структурні елементи. У розчин переходять речовини аліфатичного ряду, що являють собою периферичну частину кислоти, з'єднану з ядром на кшталт простих ефірних зв'язків. Ядра гумінових кислот, на думку більшості дослідників, не піддаються гідролізу і тому звільнені від периферичних ланцюжків повинні залишатися в осаді.
У нашому дослідженні ми скористалися зазначеним положенням та проводили виділення окремих фракцій гумінових кислот за схемою, представленою на рис. 1.
Методика дослідження
Препарат сухого гумату , який надалі піддавався гідролізу, отриманий із торфу. Гумінові кислоти та фульвові вилучалися з торфу при кип'ятінні 3-процентної NaOH, після чого осаджувалися 10-процентною HCl. Гель гумінових кислот збирався на фільтрі, промивався водою до негативної проби на хлор, потім переосаждался, висушувався при температурі 45-60°C, подрібнювався на порошок і в такому вигляді використовувався в дослідах.
Гідроліз гумінової кислоти проводився так, як це заведено для білків. Наважка кислоти в 1 г поміщалася в пробірку, заливалася 10 мл 6 н HCl, пробірка запаивалась і поміщалася в шафу на 6 годин при температурі 125-130°C.
Очищення фракцій
Після гідролізу продукти розпаду витягувалися з ампули. Ядра гумінових кислот (залишок після гідролізу) відокремлювалися від гідролізату шляхом фільтрування. Оскільки обидві фракції містили багато хлору, які передбачалося відчувати у вегетаційному досвіді, була потрібна їх попереднє очищення. Стосовно отриманих фракцій спосіб очищення був різним.
Фракція №1
Залишок після гідролізу, який мав на відміну від гуминової кислоти зовсім чорний колір і погано розчинявся в лугу, промивався на фільтрі до негативної проби на хлор. Потім із нього готувався гумат натрію. На 100 мг негідролізованого залишку бралося 2 мл 0,1 н NaOH. У вигляді такого з'єднання ця фракція йшла в досвід і на нашу припущення характеризувала фізіологічні властивості ядра гумінових кислот.
Фракції №2 та №3
Очищення гідролізату від соляної кислоти виявилося складнішим. Нами було випробувано відомий у літературі спосіб очищення гідролізату від хлору шляхом багаторазового випарювання під вакуумом (фракція № 2). Однак, оскільки в гідролізат переходила частина мінеральних солей, внаслідок чого утворювалися хлориди, остаточно позбавитися хлору виявилося неможливим. Тому були випробувані й інші методи очищення, які виявилися кращими. Одним із них є діаліз гідролізату в целофановому мішечку проти струму води до зникнення проби на хлор у промивних водах. Після діалізу в мішечку залишався забарвлений розчин, який надходив до досвіду (фракція № 3), і невеликий осад, який видалявся. Особливо помітним був осад, коли перед діалізом гідролізат нейтралізувався їдким натрієм (фракція №3-а).
Хроматографічний поділ
Оригінальним підходом до вивчення складу гуматних речовин є їхній хроматографічний поділ на активованому вугіллі з подальшою елюацією адсорбованих сполук різними розчинниками. Вперше цей метод для зазначених речовин запропонував Форсайт (1947), а згодом ним успішно користувалися Драгунов і Хан.
Пізніше з'явилася робота Дроздової, яка розробила методику очищення фульвокислот фракціонуванням на вугіллі. Ми скористалися цією методикою, вважаючи, що очищення фульвокислот із кислого розчину та очищення кислого гідролізату мають багато спільного. Гідролізат, як і фульвокислоти, має помаранчевий колір, розчинний у лугах та кислотах. При нейтралізації у точці переходу забарвлення конгорот частково випадає осад, який при подальшому підлужуванні або підкисленні знову переходить у розчин.
Фракції №4, №5 та №6
У гідролізат гумінових кислот переходять сполуки та неароматичної природи, такі як амінокислоти, аміносахара, цукроспирти, вуглеводи, уронові кислоти та ін., активність яких також необхідно було перевірити. Користуючись методом Форсайта в модифікації Дроздової, була можливість розділити гідролізат щонайменше на дві фракції і кожну окремо вивчити.
Для цього гідролізат пропускався через активований шар вугілля. Розчин, що проходить через вугілля, був безбарвним та містив, за даними Дроздової, неорганічні солі, соляну кислоту, амінокислоти, азотні основи, прості вуглеводи та ін. Цей розчин, наскільки виявилося можливим, був згущений та очищений від хлору під вакуумом і потім надійшов до досвіду (фракція № 4). Забарвлені ж речовини гідролізату, адсорбовані на вугіллі, знімалися сумішшю ацетону з лугом. Потім з елюату відганявся ацетон, залишок діалізувався в целофановому мішечку до негативної проби промивних вод на фенолфталеїн і йшов досвід (фракція № 5). Ця фракція у кислому середовищі мала лимонно-жовтий колір, а в лужному – помаранчевий. За аналогією з очищенням фульвокислот можна вважати, що фракція, що адсорбується на вугіллі, містить речовину хіноїдного характеру, оскільки позитивної реакції з α-нафтолом, реактивом Міллона і хлорним залізом воно не давало, але змінювало забарвлення в залежності від реакції середовища і мало різкий хлороподібний запах.
Необхідно відзначити, що щоб уникнути можливих втрат при десорбції та діалізі зазначена фракція гідролізату випробовувалась і безпосередньо в адсорбованому на вугіллі вигляді. При цьому активоване вугілля після пропускання через нього гідролізату відмивалося від хлору, сушилося, подрібнювалося і йшло в досвід (фракція № 6).
Результати досліджень
Біологічна активність фракцій, отриманих вказаним вище способом, та вихідної гумінової кислоти у вигляді гумату калію вивчалася у водних культурах. Як контроль бралася дистильована вода.
До судини ємністю 0,5 літра вносилося 4-6 мг препаратів гумінової кислоти. З того ж розрахунку вносилися і адсорбовані речовини на активованому вугіллі. У таблиці 1 показано вплив різних фракцій гумінової кислоти на зростання коренів ячменю, пшениці та помідорів.
| Культури | Вода | Гумат натрію (стандарт) | Гумінова кислота як адсорбент | Активоване вугілля як адсорбент | Гідролізат, адсорбований на вугіллі (фракція №6) | Гумат калію з негідролізованого залишку (фракція №1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Пшениця | 51,2 | 391,6 | --- | 283,3 | 353,3 | 401,2 |
| Ячмінь | 61,7 | 419,1 | --- | 286,6 | 401,2 | 423,3 |
| Томати | 47,7 | 60,9 | 30,7 | 44,4 | 70,0 | --- |
Ці дані свідчать, що уламки молекули гумінових кислот виявляються біологічно активними. Гумат калію, приготовлений з залишку негидролизуемого, по стимуляції росту коренів не поступається стандартному розчину гумату калію. Отже, ядру гумінових кислот, очевидно, належить провідна роль стимуляції зростання коренів. Разом з тим, у досвіді відзначається також досить сильна стимуляція речовинами, які після гідролізу адсорбуються на вугіллі. Якщо врахувати, що ці речовини відносяться до поліфенольних та хінонних сполук, то отриманий у досвіді ефект можна пояснити безпосереднім впливом на рослину.
Нами було помічено також, що саме активоване вугілля як адсорбент також викликає посилене зростання коренів. Деякі дослідники таку дію пояснюють здатністю вугілля адсорбувати іони водню, що виділяються кореневою системою, завдяки чому вугілля сприяє процесу дихання та мінеральному живленню рослин. П. А. Власюк, наприклад, рекомендує внесення до рядків бурого вугілля як адсорбенту, який зменшує концентрацію солей у зоні коренів та покращує харчування культур.
Тому в досліді з томатами нами використовувалося активоване вугілля, яке перед постановкою досліду було промите міцною соляною кислотою, потім відмитий від хлору, частина його йшла на адсорбцію гідролізату, а інша вносилася в чистому вигляді до досвіду. При порівнянні зростання коренів пшениці, ячменю і томатів у довжину можна побачити, що у активованому куті є домішки, які можуть спотворити результати досліджень, оскільки сприяють зростанню коренів. Адсорбована ж речовина на вугіллі і в цьому випадку виявляється біологічно активною.
З цього досвіду можна також переконатися, що сама гумінова кислота у вигляді тонкоастертого гелю як адсорбент ефект не дає. Ці адсорбенти дійсно мають різні властивості, тому що мають різну ємність поглинання (табл. 2).
| Адсорбент | Місткість поглинання (%) |
|---|---|
| Активоване вугілля | 11,8 |
| Активоване вугілля, оброблене HCl | 11,3 |
| Активоване вугілля з адсорбованим гідролізатом | 10,6 |
| Гель гумінової кислоти | 5,4 |
| Негідролізований залишок | 0,0 |
Порівняння ємностей поглинання вугілля і гелю гумінової кислоти показує, що якби в наших дослідах позитивний вплив вугілля на зростання коренів пояснювалося адсорбційною здатністю, гель гумінової кислоти також виявився б ефективним, тоді як насправді він навіть трохи гнітить зростання кореневої системи.
Нижче (табл. 3) наведено результати досліду, в якому випробовувалися фракції гумінових кислот після десорбції з активованого вугілля.
| Варіанти досвіду | Ячмінь (досвід №1) | Помідори (досвід №2) | Ячмінь (досвід №3) |
|---|---|---|---|
| Вода (контроль) | 116,6 | 47,7 | 295,0 |
| Гумат калію (стандарт) | 146,6 | 60,9 | 365,0 |
| Гідролізат після видалення хлору (фракція №2) | --- | --- | 395,0 |
| Фракція гідролізату, десорбована з активованого вугілля (фракція №5) | 261,6 | 65,9 | --- |
| Фракція гідролізату, що не адсорбується вугіллям (фракція № 4) | --- | --- | 230,0 |
| Гідролізат після діалізу (фракція №3) | 131,6 | 62,1 | --- |
| Гідролізат після діалізу з попередньою нейтралізацією (фракція №3-а) | 183,3 | 53,6 | --- |
Висновки
З цих дослідів видно, що суміш продуктів гідролізу (фракція № 2) виявляється активнішою, ніж фракція речовин, яка не адсорбується на вугіллі і в яку імовірно входять периферичні ланцюжки гумінових кислот. Отже, біологічна активність гумінових кислот, очевидно, залежить від тієї фракції, яка адсорбується на вугіллі і яка по ряду ознак.
Попередня нейтралізація гідролізату лугом перед діалізом призводить до зниження стимуляційного ефекту, мабуть, через те, що в результаті нейтралізації активні речовини переходять в осад, який після діалізу був видалений.